Wojciech Kamysz
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe, Lipopharm.pl
strony wersji drukowanej: 22-25


Poszukiwanie skutecznych substancji o znaczeniu terapeutycznym i diagnostycznym w ostatnich latach w dużej części skupia się wokół syntetycznych oligo- i polipeptydów. Peptydy stanowią wielce obiecującą grupę substancji. Mnogość tworzonych przez nie struktur powoduje, że związki te wykazują rozmaite działania biologiczne.  W badaniach znajdują się tysiące nowych naturalnych jak i typowo syntetycznych peptydów. Pozyskiwanie tych związków na skalę laboratoryjną oraz przemysłową stanowi jednak ciągle duże wyzwanie. Jednym z najważniejszych etapów jest oczyszczanie wyizolowanego lub otrzymanego syntetycznie produktu. Metody oczyszczania peptydów były udoskonalane przez ponad pół wieku od historycznego otrzymania syntetycznej oksytocyny przez Vigneaud (1954 r.), czy opracowania syntezy na stałym nośniku polimerowym (Merrifield, 1961 r.). Mimo to nie ma nadal jednej, uniwersalnej  techniki pozyskiwania czystych związków. Zmiana czasem jednego aminokwasu w sekwencji peptydu na inny zmienia do tego stopnia właściwości związku, że zawodzą dotychczas stosowane metody. Zdarza się, że najbardziej wytrwali syntetycy mają problemy z niepozornie wyglądającymi peptydami.  Sytuacje takie powodują, że oczyszczanie peptydów jest jednym z najtrudniejszych etapów pozyskiwania tych związków. Sposób izolacji oraz oczyszczania peptydów przez lata był podyktowany dostępnymi metodami rozdziału oraz możliwościami analitycznymi. Rozwój technik analitycznych opartych o spektrometrię mas oraz wysokorozdzielczych metod chromatograficznych i elektroforetycznych narzucił też nowe standardy badania czystości peptydów. Peptydy, które kiedyś analizowane wyłącznie metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) były uważane za czyste, nie spełniały by współczesnych wymagań czystości.

Nietrwałość peptydów
Synteza peptydów
U podstaw problemów związanych z czystością peptydów leży najczęściej podatność ich struktury na zmiany chemiczne. Obecność w strukturze łańcucha peptydowego łańcuchów bocznych aminokwasów zawierających różne reaktywne grupy funkcyjne powoduje, że peptydy są podatne na różne czynniki zewnętrzne zarówno podczas syntezy chemicznej, oczyszczania surowych produktów jak i późniejszego przechowywania. Jest wiele różnych typów reakcji chemicznych zachodzących podczas syntezy i oczyszczania peptydów. Już podczas syntezy zachodzić może agregacja lub racemizacja. Peptydy nawet oczyszczone mogą w roztworach wodnych ulegać hydrolizie, deamidacji, czy utlenianiu.

Rozwój metod otrzymywania peptydów
Od wczesnych lat 60-tych XX wieku peptydy w dużej mierze otrzymywane są metodą na stałym nośniku polimerowym. Technika ta polega na przyłączeniu pierwszego aminokwasu do nierozpuszczalnego nośnika i dobudowywaniu kolejnych aminokwasów z pominięciem konieczności kłopotliwej krystalizacji produktów pośrednich. Przez lata metoda ta była uważana za bardzo drogą jednak czynniki ekonomiczne związane z kosztami personelu oraz ograniczeniami czasowymi skłoniły nawet przemysł do przejścia na syntezę na nośniku. W chwili obecnej stosuje się dwie metody syntezy. Metodę z wykorzystaniem chemii Boc- oraz nowszą chemię Fmoc. Otrzymane w wyniku syntezy metodą Boc peptydy charakteryzują się wysokim stopniem zanieczyszczenia produktami różnych reakcji zachodzących podczas kondensacji kolejnych aminokwasów oraz deprotekcji finalnego produktu z nośnika polimerowego. Rozwój nowych technik syntezy w oparciu o chemię Fmoc spowodował, że związki już po syntezie są przyzwoitej jakości. Czystość surowych produktów sięga nawet 90%, a oczyszczanie takich próbek jest stosunkowo proste i tanie. Biorąc pod uwagę fakt, że peptydy należą do substancji o bardzo wysokiej aktywności biologicznej, zwykle nie ma potrzeby budowania chromatografów procesowych. Do oczyszczania peptydów w laboratorium wystarczy prosty chromatograf preparatywny wyposażony w pompę gradientową i detektor spektrofotometryczny. Większość znanych leków peptydowych otrzymuje się bowiem zaledwie w skali do 100kg w roku. Laboratoria badawcze mogą z sukcesem korzystać z jednego, wspólnego dla analizy i oczyszczania peptydów w skali semipreparatywnej chromatografu cieczowego. Większość bowiem dostępnych urządzeń HPLC umożliwia przepływy w zupełności wystarczające do obsługi kolumn o średnicy nawet do 16 mm. Jedynym ograniczeniem może być objętość pętli nastrzykowej dozownika, która do naniesienia oczyszczanej próbki musi posiadać większą objętość. Pętla stanowi jednak jeden z najtańszych elementów zestawu. HPLC i może być bez wielkiego nakładu pracy zamieniana.

Współczesne oczyszczanie peptydów
Wraz z rozwojem metod syntezy rozwijały się metody oczyszczania tych związków. Do dziś dnia w niektórych laboratoriach można spotkać eksperymentatorów czyszczących peptydy na typowym żelu krzemionkowym czy preparatywnych płytkach TLC. Z chromatografii kolumnowej stosuje się nadal chromatografię jonowymienną oraz sączenie na żelach (filtrację żelową) na złożach dekstranowych. Należy tutaj wspomnieć, że skuteczny rozdział peptydu na złożu Sephadex od podobnych strukturalnie zanieczyszczeń uzyskuje się podczas rozdziału trwającego nawet kilka dni. Chromatografia jonowymienna, chromatografia metalopowinowactwa oraz filtracja żelową z po-wodzeniem nadal są stosowane w oczyszczaniu dużych białek. Oczyszczanie w ten sposób peptydów przez niektóre zespoły naukowe podyktowane jest jednak nadal brakiem dostępu do współczesnych (dostępnych od lat 70-tych!) metod opartych o wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z wykorzystaniem chromatografów gradientowych. Powszechnie wiadomo, że peptydy należą do struktur o niskiej trwałości chemicznej podczas otrzymywania oraz późniejszego przechowywania. Gotowe (czyste) związki z sukcesem zabezpiecza się przed utratą trwałości poprzez suszenie liofilizacyjne oraz pakowanie w atmosferze gazów obojętnych. HPLC, szczególnie oparte o układ faz odwróconych, jest obecnie uważane za standard zarówno w laboratorium naukowym, ale i przemysłowym. Próby zastosowania innych metod oczyszczania peptydów na przełomie ostatnich lat zwykle kończyły się powrotem do HPLC. Separacja peptydu od często bardzo podobnych zanieczyszczeń (zwykle też peptydów), wymaga bowiem metod wysokorozdzielczych. Z pomocą przychodzą też metody masowe, które potwierdzają tożsamość, ale też często zgrubnie czystość analizowanych związków.

Chromatografia preparatywna
Zwykle stosuje się układ faz odwróconych. Fazę ruchomą stanowi układ rozpuszczalników woda-acetonitryl. Wykorzystanie acetonitrylu niesie ze sobą wiele zalet. Jest on łatwy do odparowania z próbek (frakcji), wykazuje bardzo niską absorbancję w badanym zakresie UV (dla peptydów zwykle 214nm) oraz posiada niską lepkość, co znajduje swoje odbicie w niskich ciśnieniach wstecznych podczas rozdziału. Nie bez znaczenia jest tez przyzwyczajenie eksperymentatorów, którzy stosują ten rozpuszczalnik od samego początku historii HPLC. Alternatywnie, chociaż niezmiernie rzadko  stosuje się alkohole metylowy lub etylowy. Do fazy ruchomej dodaje się jeden z długiej listy modyfikatorów, które mają za zadanie hamowanie oddziaływań nieselektywnych analizowanych związków chemicznych z wolnymi grupami silanolowymi na powierzchni sorbentu. Najczęściej stosuje się 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA), który ma podobne zalety jak acetonitryl. Przede wszystkim jest on łatwy do usunięcia z próbki.  Do znanych modyfikatorów należy też kwas heptafluoromasłowy (HFBA) oraz fosforan trietylominy (TEAP). Jako fazę stacjonarną w oczyszczaniu peptydów stosuje się podobne złoża jak w rozdziałach analitycznych. Różnica w kolumnach analitycznych i preparatywnych polega na większej średnicy kolumny oraz większej średnicy ziaren sorbentu (zwykle 7 lub 10 µm). Jako wypełnienia kolumn stosuje się krzemionkę modyfikowaną łańcuchami alkilowymi C8 lub C18. Ilość peptydu możliwa do oczyszczenia na tego typu kolumnach przedstawia tabela 1.


Tabela 1. Typy kolumn stosowanych w oczyszczaniu peptydów metodą HPLC.



Inne przemysłowe metody oczyszczania peptydów
Poza typowymi rozdziałami peptydów z użyciem HPLC jako metody uniwersalnej i dającej bardzo dobre efekty przemysł nadal korzysta z metod starszych i sprawdzonych. Do metod tych należą przede wszystkich chromatografia jonowymienna stosowana jako jedna z pierwszych metod chromatograficznych oraz filtracja żelowa. Podstawową zaletą chromatografii jonowymiennej jest cena eluentów. Zwykle stosuje się roztwory wodne soli nieorganicznych a rozdziały prowadzi się w gradiencie pH lub gradiencie nieorganicznej soli. Samo złoże niewiele różni się od wymieniaczy jonowych stosowanych powszechnie w przemyśle do zmiękczania wody, tym samym jonowymieniacze te nie mogą być drogie. Ziarna jonitu zbudowane są zwykle z polistyrenu sieciowanego diwinylobenzenem a w tą matrycę wbudowuje się różne ugrupowania jonowe (kationowe lub anionowe). Same ziarna jonitów wykazują dużą porowatość a co za tym idzie dużą zdolność wymiany jonów. Droższe jonity typu „fast flow” stosowane głównie w laboratoriach naukowych otrzymuje się na bazie agarozy. Niewątpliwą wadą wymieniaczy jonowych jest niska odporność na wysokie temperatury. Na innej zasadzie działa  filtracja żelowa. Stosuje się ja głównie do oczyszczenia peptydów ze składników niskocząsteczkowych (np. cukrów) lub typowego odsolenia próbek  po syntezie lub oczyszczaniu na jonicie. Selektywność rozdziału jest uzyskiwana poprzez różnice w wielkości cząsteczek oczyszczanych substancji. Małe związki wnikają do środka ziaren, duże „omijają” ziarna i przemieszczają się wraz z roztworem rozpuszczalnika ku dołowi kolumny. Ponieważ niskocząsteczkowe peptydy po pewnym czasie opuszczają ziarna obserwuje je się w kolejnych frakcjach eluatu. W zależności jakie masy cząsteczkowe posiadają składniki mieszaniny stosuje się różne żele Sephadex. Najmniejsze peptydy oczyszcza się na złożu Sephadex G-10 (rozdziela masy mniejsze od 700 Da), większe na G-15, G-20 lub LH-20 (hydroxypropylowany żel G-15). Duże polipeptydy i białka nanosi się na kolumny typu G o wyższych numerach. Główne zasady stosowane podczas rozdziałów na żelach to mała objętość próbki (najlepiej maksymalnie 1ml), stosunkowo powolny przepływ fazy ruchomej, tak aby cały rozdział trwał 1-2 dni oraz długa kolumna chromatograficzna (zwykle 100 cm). Techniką filtracji żelowej na klasycznej kolumnie o średnicy 2 cm można oczyścić stosunkowo niewielką ilość substancji (50-100mg) i to jest niewątpliwie jedna z ważniejszych wad tej metody.

Podsumowanie
Dobór odpowiedniej techniki oczyszczania peptydów jest trudny i od tego etapu zależy finalny sukces otrzymania peptydu o wymaganej czystości. Wiedza na temat współczesnych, ale i czasem historycznych metod oczyszczania jest konieczna celem opracowania odpowiedniej strategii oczyszczania i późniejszego zatężania frakcji peptydowej przed procesem suszenia. Zwykle oczyszczanie jest dwuetapowe i wykorzystuje chromatografie jonowymienną, a finalny produkt doczyszcza się z wykorzystaniem HPLC.