Maciej Jaśkiewicz
Gdański Uniwersytet Medyczny
strony wersji drukowanej: 24-31



Rozwój przemysłu farmaceutycznego związany jest nie tylko z wprowadzaniem nowych, bardziej skutecznych leków, lecz również z udoskonalaniem jakości uzyskiwanych produktów. Bezpieczeństwo stosowania substancji leczniczych jasno koreluje z dobrą praktyką i przestrzeganiem procedur wytwarzania. Nowe rodzaje farmaceutyków wymuszają na producentach jak i organach kontrolnych definiowanie wytycznych dotyczących jakości uzyskiwanych produktów. Niewątpliwie ważnym parametrem każdej substancji leczniczej jest odpowiednia jakość mikrobiologiczna. Ponadto wprowadzanie do obrotu nowych rodzajów substancji leczniczych wymusza ciągłą aktualizację norm jakości mikrobiologicznej poszczególnych grup leków. Regulacje te w znacznej mierze definiują opracowania farmakopealne.

MIKROBIOLOGICZNA JAKOŚĆ PROCESU WYTWARZANIA
Niezwykle ważne dla uzyskania produktu wysokiej jakości jest przestrzeganie zasad GMP (Good Manufacturing Practice – dobra praktyka wytwarzania). W tym celu przeprowadzane są okresowo kontrole – badania walidacyjne, skupiające uwagę przede wszystkim na prawidłowości procesu produkcyjnego. Walidacja pod kątem mikrobiologicznym powinna obejmować kontrolę czystości powietrza, powierzchni (metodą kontaktową, płytkową lub sedymentacyjną), kontrolę jałowości wody, ocenę sprawności aparatury sterylizującej metodami biologicznymi). Ponadto oceniona powinna być skuteczność środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych oraz substancji konserwujących. Niemniej ważna jest również ocena personelu obejmująca nie tylko badanie wyposażenia (tj. fartuchów, ubrań czy rękawic) lecz również badanie nosicielstwa w górnych drogach oddechowych.

BADANIE CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ PRODUKTÓW LECZNICZYCH
Do głównych założeń określenia jakości mikrobiologicznej produktów leczniczych należy między innymi: wykrycie obecności drobnoustrojów w badanej próbce, scharakteryzowanie ich pod względem ilościowym, a także ich szczegółowa identyfikacja i charakterystyka. Ponadto istotnym parametrem jest oznaczenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej substancji czynnych obecnych w badanej próbie (tj. antybiotyków, środków konserwujących, antyseptycznych czy też witamin) w stosunku do testowych, referencyjnych szczepów bakterii lub grzybów. Normy jakie muszą zostać spełnione wynikają również z rodzaju produktu leczniczego, które pod tym względem dzielimy na produkty jałowe oraz niejałowe.

PREPARATY JAŁOWE
Preparaty jałowe, są to takie substancje, które zgodnie z wymaganiami farmakopealnymi muszą być jałowe i w badaniu jałowości powinny charakteryzować się brakiem drobnoustrojów oraz ich przetrwalników. Badanie jałowości wykonuje się w warunkach aseptycznych, odpowiednio dostosowanych do użytej metody. Warunki te powinny być nadzorowane oraz regularnie kontrolowane poprzez pobieranie próbek z obszaru pracy. Zadowalający wynik badania świadczy o niewykryciu zanieczyszczeń drobnoustrojami tylko w próbce badanej w warunkach badania.

Do substancji leczniczych jałowych zalicza się:

  • Preparaty do podawania pozajelitowego (do infuzji),
  • Preparaty do oczu, w tym krople, maści,
  • Preparaty stosowane na rany oraz poparzenia,
  • Preparaty do uszu,
  • Preparaty stosowane do irygacji – np. otrzewnej.

Niezwykle ważną rolę w tego typu preparatach odgrywają również wyroby medyczne takie jak igły, strzykawki, cewniki służące do podania tych leków. One także powinny spełniać kryterium jałowości. Ponadto wiele spośród tych preparatów wytwarzanych jest w opakowaniach do wielokrotnego zastosowania. W związku z tym do produktów tych dodaje się odpowiedniej substancji konserwującej lub też stosuje się opakowania uniemożliwiające wniknięcie powietrza po aplikacji. Dostępne są także takie, które zawierają filtry o wielkości porów nie większej niż 0,22 μm, co stanowi barierę uniemożliwiające przedostanie się drobnoustrojów znajdujących się w powietrzu.

Wyróżniamy trzy następujące metody badania jałowości:

Metoda posiewu bezpośredniego – w niej do podłoża hodowlanego (podłoże tioglikolanowe dla bakterii tlenowych i beztlenowych; bulion kazeinowo – sojowy dla grzybów jak i bakterii tlenowych) wprowadza się bezpośrednio badany produkt w ilości ściśle zdefiniowanej (tab. 1).


Tab 1. Minimalna ilość badanej substancji używana do posiewu.



Metoda bezpośredniego posiewu z neutralizacją środka przeciwdrobnoustrojowego – jeśli badany produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe badanie należy wykonać po zneutralizowaniu produktu odpowiednią substancją neutralizującą lub po rozcieńczeniu w odpowiednio dużej objętości podłoża.

Badanie metodą filtracji z użyciem sączków membranowych – w tym wypadku badanie to stosuje się wobec substancji, które posiadają właściwości umożliwiające ich filtrację: wodnych preparatów dających się sączyć, preparatów olejowych, alkoholowych lub rozpuszczających się w wodzie czy też rozpuszczalnikach olejowych (nie wykazujących właściwości przeciwdrobnoustrojowych). Nominalna wielkość porów powinna być nie większa niż niż 0,45 μm, a wartość ta powinna mieć ustaloną skuteczność zatrzymywania drobnoustrojów. Po przefiltrowaniu badanej substancji sączek umieszcza się w podłożu hodowlanym (jeśli jest możliwość przecięcia sączka w warunkach aseptycznych – do dwóch odpowiednich podłoży hodowlanych).

Preparaty podawane pozajelitowo muszą nie tylko spełniać kryterium jałowości, lecz także nie mogą zawierać substancji gorączkotwórczych – pirogenów. Wyróżniamy szereg metod umożliwiających wykrycie substancji o charakterze pirogennym:

Pierwsza metoda – obejmuje badanie przyrostu temperatury ciała królików po wstrzyknięciu dożylnym jałowego roztworu substancji badanej. Temperatura wyjściowa badanych zwierząt nie powinna podlegać wahaniom większym niż 0,2 ºC, a różnica temperatur pomiędzy poszczególnymi osobnikami nie powinna przekraczać 1ºC. Kryteria akceptacji oraz interpretacja wyników zostały przedstawione w tabeli poniżej (tab. 2). Jeśli uzyskany średni przyrost temperatury przekracza wartość akceptacji, lecz nie przewyższa wartości dyskwalifikujących – badanie należy powtórzyć.


Tab. 2. Kryteria akceptacji.



Test obecności endotoksyn bakteryjnych (test LAL) – celem tej metody jest wykrycie lub oznaczenie zawartości endotoksyn bakterii Gram-ujemnych używając przy tym lizatu amebocytów skrzypłocza (Limulus polyphemus lub Tachypleus tridentatus). Obecność endotoksyn powoduje powstanie skrzepu.

Wyróżnia się trzy techniki badania :
 
  • żelową (polegającą na utworzeniu żelu),
  • turbidymetryczną (wywołanie zmętnienia w skutek rozszczepienia substratu),
  • chromogenną (polegającą na wywołaniu zmętnienia w skutek rozszczepienia syntetycznego kompleksu peptyd-chromogen).

W teście tym wykorzystujemy specjalnie przygotowany roztwór lizatu amebocytów, roztwór wzorca endotoksyny – jako kontrola dodatnia, woda LAL (woda do wstrzykiwań OD) jako kontrola ujemna.

Badanie aktywacji monocytów (MAT- monocyte activation test) – jest to metoda pośrednia, używana do wykrywania jak i ilościowego oznaczania substancji zdolnych do aktywacji ludzkich monocytów lub komórek monocytarnych. W obecności pirogenów dochodzi do wydzielania endogennych mediatorów takich jak cytokiny prozapalne: TNFα (Tumor necrosis factor – czynnik martwicy guza), interleukina-1 β czy interleukina-6. Cytokiny te odgrywają znaczącą rolę w patogenezie gorączki. Badanie to pozwala na wykrycie pirogenów bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych, w związku z czym może w przyszłości zastąpić badania z użyciem żywych zwierząt.

PREPARATY NIEJAŁOWE
Wszystkie środki lecznicze niejałowe powinny spełniać odpowiednie kryteria czystości mikrobiologicznej. Obecność drobnoustrojów w preparatach niejałowych może znosić lecznicze właściwości substancji, co w konsekwencji również może niekorzystnie wpływać na zdrowie pacjentów. W związku z tym na producentach spoczywa odpowiedzialność zapewnienia niskiego poziomu zanieczyszczeń w końcowej postaci leku. Ważne jest, aby tak jak przy produkcji substancji jałowych przestrzegać zasad GMP. Kryteria akceptacji dla tej grupy preparatów oparte są na ogólnej liczbie drobnoustrojów tlenowych TAMC (total aerobic microbial count) i ogólnej liczbie pleśni i drożdży TYMC (Total yeast/moulds count) i oparte jest na pojedynczych lub na uśrednionych wynikach z wielu oznaczeń (tab. 3).


Tab.3 Kryteria akceptacji dla mikrobiologicznej jakości produktów niejałowych.



Wśród metod stosowanych w określaniu jakości mikrobiologicznej wyróżniamy:

Metody z użyciem sączków membranowych – tej metody również używamy tylko w przypadku wodnych preparatów dających się sączyć, preparatów olejowych, alkoholowych lub rozpuszczających się w wodzie czy też rozpuszczalnikach olejowych. Należy użyć takiego aparatu, aby możliwe było aseptyczne przeniesienie sączka do podłoża. W tym wypadku należy użyć 2 sączków, nanieść na nie odpowiednią ilość badanej próbki i natychmiast sączyć. W celu oznaczenia TAMC przenieść sączek na powierzchnię podłoża agarowego z hydrolizatem kazeiny i soi (inkubować 3-5 dni w temperaturze 30-35 ºC), natomiast w celu oznaczenia TYMC przenieść drugi sączek na powierzchnię agaru Sabouraud z dekstrozą (inkubować 5-7 dni w 20-35 ºC).

Metody bezpośredniego posiewu – wyróżniamy dwie metody: płytek lanych oraz posiewu powierzchniowego. Dla pierwszej z nich przygotowujemy po co najmniej 2 płytki Petriego na każde podłoże i każde rozcieńczenie. W celu określenia TAMC badaną substancję mieszamy z agarem hydrolizatu kazeiny i soi, świeżo przygotowanym, wysterylizowanym i schłodzonym (temperatura nie wyższa niż 45 ºC). Po zastygnięciu przygotowane płytki inkubujemy przez 3-5 dni w temp 30-35 ºC. TYMC wyznaczamy analogicznie stosując jako pożywkę agar Sabouraud z dekstrozą i inkubujemy w 20-25 ºC przez 5-7 dni. Wynik uzyskany jest średnią arytmetyczną liczby kolonii dla różnych płytek o różnym rozcieńczeniu i wyrażany jest w CFU (colony forming units – jednostki tworzące kolonie) na gram lub mililitr produktu. Dla metody posiewu powierzchniowego również przygotowujemy po co najmniej 2 płytki dla każdego podłoża oraz rozcieńczenia. Na szalki Petriego ze zestalonym podłożem nanosi się po 100 μL kolejno wybranych rozcieńczeń i rozprowadza jałową głaszczką na powierzchni całego podłoża, aż do wyschnięcia. Inkubacja i wyznaczanie liczby CFU wykonuje się tak samo jak w przypadku metody płytek lanych.

Metoda oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby – jest najmniej precyzyjna i dokładna. Stosuje się ją tylko do określenia TAMC i jedynie w sytuacjach, gdy nie może być zastosowana inna metoda. Przygotowuje się co najmniej 3 serie 10-krotnych rozcieńczeń badanej próbki. Z każdego poziomu rozcieńczenia przygotowuje się po 3 porcje (1g lub 1mL), które następnie zaszczepia się w bulionie lub agarze (schłodzonym do 45 ºC) hydrolizatu kazeiny i soi. Jeśli jest konieczne można do podłoża dodać związek powierzchniowo czynny – taki jak polisorbat 80 lub substancję neutralizującą czynniki przeciwdrobnoustrojowe.

Również istotnym kryterium dla preparatów niejałowych niejałowych jest brak obecności określonych drobnoustrojów. Dla prawie wszystkich rodzajów produktów (poza podawanymi doodbytniczo) istotnym kryterium jest nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL badanej substancji. Preparaty podawane na śluzówkę jamy ustnej, dziąsła , skórę, donosowo czy też dousznie nie powinny zawierać Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa. W preparatach dopochwowych prócz tych dwóch drobnoustrojów nie powinna być stwierdzona obecność Candida albicans, a substancje podawane wziewnie nie powinny zawierać bakterii Gram-ujemnych tolerujących żółć. Jedynie dla doustnych postaci leku zawierające surowce pochodzenia naturalnego (nie poddane wstępnej obróbce) akceptowalna jest obecność tej grupy bakterii w ilości nie przekraczającej 102 CFU/g lub mL badanej substancji. Preparaty te wraz z ziołowymi produktami leczniczymi nie powinny zawierać również bakterii z rodzaju Salmonella w 10g lub 10 mL substancji.

BEZPIECZEŃSTWO I JAKOŚC MIKROBIOLOGICZNA – POZOSTAŁE ASPEKTY
W trakcie wytwarzania niektórych substancji leczniczych, w tym produktów biotechnologicznych i szczepionek wykorzystywane są hodowle in vitro zarówno komórek jak i tkanek. W tym przypadku bardzo istotnym elementem jest zapewnienie czystości mikrobiologicznej. Niezwykle istotne jest wykluczenie obecność trudnych do wykrycia drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium czy Mycoplasma. Należy zwrócić szczególną uwagę na surowce pochodzenia naturalnego, które podatne są na skażenie mikrobiologiczne głównie szczepami grzybów wytwarzających toksyny takie jak aflatoksyna B1 czy też ochratoksyna.

Określenie jakości mikrobiologicznej sprowadza się do przeprowadzania badań, które często wymagają długiego czasu inkubacji. W przypadku Mycobacterium prawidłowe oznaczenie trwa 8 tygodni, a Mycoplasma 35 dni. Wprowadzenie radiofarmaceutyków oraz nośników biologicznych do preparatów wymusza konieczność stosowania metod pozwalających na szybkie i dokładne określenie jakości mikrobiologicznej produktów. Wśród tych metod wyróżniamy:

Bioluminescencja ATP – w metodzie tej wykorzystany jest fakt, że w obecności ATP dochodzi do specyficznej reakcji : utlenienia lucyferyny (w obecności lucyferazy, jonów Mg2+). Forma utleniona charakteryzuje się podwyższonych stanem energetycznym, który powracając do stanu podstawowego emituje energię w postaci światła. Ilość ta proporcjonalna jest do ilości ATP (tabela 4).


Tab.4 Przykładowa zawartość ATP wśród drobnoustrojów.



Epifluorescencja – metoda ta polega na bezpośrednim zliczaniu drobnoustrojów, po oznakowaniu ich związkami fluorescencyjnymi.

Cytometria przepływowa – w metodzie tej wykorzystywany jest fakt pomiaru fluorescencji w przepływie. Stosując cystometrię przepływową można szybko oznaczyć nie tylko ilość, ale też dokładnie scharakteryzować drobnoustroje obecne w próbce. W tym celu stosuje się znakowane barwnikami fluorescencyjnymi przeciwciała skierowane przeciwko charakterystycznym dla danych drobnoustrojów antygenom.

Impedymetria – wzrost drobnoustrojów w podłożach hodowlanych powoduje rozpad białek, polisacharydów i tłuszczów do dobrze dysocjujących związków takich jak aminokwasy czy też kwasy tłuszczowe. Dochodzi do zmiany przewodności elektrycznej układu, która jest wprost proporcjonalna do ilości mikroorganizmów.

WPŁYW WODY NA JAKOŚĆ MIKROBIOLOGICZNĄ
Wzrost mikroorganizmów możliwy jest tylko w obecności wody. Aktywność wody (aw) jest terminem określającym zapotrzebowanie drobnoustrojów na wodę. Wielkość ta wskazuje na zawartość wody niezwiązanej krystalicznie lub atomowo, która może przyspieszać szybkość reakcji chemicznych oraz jest istotna dla rozwoju mikroorganizmów. Czysta chemicznie woda ma aktywność równą 1 i maleje wraz ze wzrostem stężenia substancji rozpuszczonych. Im wartość ta jest niższa, tym korzystne oddziaływanie wody na drobnoustroje maleje (optymalna wartość aw dla większości bakterii wynosi 0,96-0,99). Wartość tą można obniżać poprzez dodatek cukrów, glikolu etylenowego, suszenie czy też zatężanie. Bakterie Gram-ujemne nie rosną w środowisku o aw < 0,95, Staphylococcus, Micrococcus czy Lactobacillus gdy aw <0,9, drożdże <0,8, a Aspergillus < 0,6.

PODSUMOWANIE
Odpowiednia jakość mikrobiologiczna preparatów stosowanych w lecznictwie jest niezwykle ważnym kryterium decydującym o bezpieczeństwie ich użycia. Zastosowanie zanieczyszczonego leku, w przypadku chociażby chorego o obniżonym poziomie odporności może przynieść katastrofalne w skutkach rezultaty. W fazie produkcji nie ma mowy o jakichkolwiek uchybieniach w przestrzeganiu procedur bezpieczeństwa i prawidłowej praktyki wytwarzania. Wiele spośród substancji stosowanych w lecznictwie musi spełniać rygorystyczne kryteria jałowości. Jednak niektóre z nich, ze względu na drogę podania lub miejsce działa nie muszą spełniać tak surowych norm. Niemniej ważne jest, aby wartości tego skażenia oscylowały w ściśle określonych, bezpiecznych dla zdrowia granicach. Rozwój przemysłu farmaceutycznego przyczynia się do powstawania nowych grup leków, w tym również pochodzenia naturalnego. Ważne jest, aby odpowiednie organy natychmiastowo reagowały na sytuację obecną na rynku i wprowadzały odpowiednie wytyczne. Globalizacja rynku farmaceutycznego wymusza konieczność ujednolicenia obowiązujących kryteriów i norm.


PIŚMIENNICTWO:

1. Farmakopea Polska IX, Tom 1. Polskie Towarzystwo farmaceutyczne, Warszawa, 2011.

2. Farmakopea Polska VIII, Suplement. Polskie Towarzystwo farmaceutyczne, Warszawa, 2009.

3. Załącznik do rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 17.08.2009 r., Załącznik nr 1 Aneks 1, Wytwarzanie sterylnych produktów leczniczych.

4. Tyski S.: Sposób na czysty lek. Przemysł farmaceutyczny, 3, 2011.

5. Kręgiel D. Higiena produkcji pod kontrolą. Agro przemysł 1/2012.