Wojciech Kamysz, Maciej Jaśkiewicz
Gdański Uniwersytet Medyczny
strony wersji drukowanej: 52-56



Bakterie od wieków towarzyszą ludzkości, a związane z nimi infekcje nadal są jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. Niewątpliwie milowym krokiem w walce z tymi patogenami było odkrycie antybiotyku – penicyliny w 1928 roku przez Aleksandra Fleminga. Współcześnie medycyna dysponuje szeregiem substancji o aktywności przeciwbakteryjnej, zarówno o wąskim jak i szerokim spektrum oddziaływania. Dlatego też, istotną rolę z punktu widzenia klinicznego odgrywa diagnostyka laboratoryjna. Przy zastosowaniu technik mikrobiologicznych jesteśmy w stanie określić zarówno konkretną przyczynę infekcji, a także wrażliwość bakterii na konwencjonalne środki przeciwdrobnoustrojowe. Na podstawie uzyskanych wyników badań, lekarz jest w stanie wydajnie pokierować procesem terapeutycznym, ratując zdrowie, a niekiedy życie pacjenta. Niestety, w obliczu powszechnego stosowania antybiotyków u bakterii rozwinęły się mechanizmy oporności. W konsekwencji, niektóre z dotychczas stosowanych środków stają się nieefektywne. Proces terapeutyczny wymaga zastosowania większych dawek lub też silnych antybiotyków, których stosowanie niejednokrotnie bywa szkodliwe dla zdrowia człowieka. Obecnie oporność bakterii na antybiotyki jest jednym z najważniejszych zagadnień medycyny i stanowi istotny problem epidemiologiczny. Dlatego też szczególna uwaga naukowców skupia się na projektowaniu nowych związków o aktywności aktywności przeciwdrobnoustrojowej, równocześnie udoskonalając warsztat metod jej weryfikacji przy pomocy zaawansowanych technik laboratoryjnych. Należy również podkreślić rozwój w dziedzinie diagnostyki infekcji bakteryjnych, gdzie główną rolę odrywa coraz doskonalsza metodyka oraz aparatura.

Diagnostyka bakteriologiczna w laboratorium medycznym
Do najważniejszych celów diagnostyki mikrobiologicznej należy: identyfikacja drobnoustroju, oznaczenie jego wrażliwości na antybiotyki oraz określenie korelacji pomiędzy objawami klinicznymi, a zweryfikowaną przyczyną infekcji. Konsekwencją jest wdrożenie odpowiedniej terapii lub też dalszej diagnostyki.

Wyróżniamy dwie metody wykazania obecności bakterii:

1. Metody bezpośrednie – pozwalające stwierdzić obecność czynników zakaźnych lub też ich produktów np. toksyn. Wśród nich znajdziemy metody klasyczne takie jak:

Badanie mikroskopowe (zarówno preparatu bezpośredniego jak i barwionego)

Hodowla, izolacja oraz identyfikacja drobnoustrojów. Na tym etapie materiał pobrany od pacjenta, w zależności od rodzaju zakażenia, posiewany jest na podłoże namnażające lub selektywne. W niektórych sytuacjach konieczne jest posianie próbki bezpośrednio przy pobraniu. Następnym etapem jest izolacja, w celu wykonania antybiogramu. Czas trwania rutynowego badania mikrobiologicznego może wynosić 24-72 godziny w przypadku bakterii szybko rosnących. Dla niektórych drobnoustrojów okres ten może trwać nawet 14 dni.

Ocena lekowrażliwości (antybiogram). Antybiogram jest nieodzowną składową badania mikrobiologicznego i stanowi podstawę do wyboru leku przeciwbakteryjnego. Do metod oznaczania należą: metoda dyfuzyjno-krążkowa pozwalająca na na określenie wrażliwości lub oporności izolatu na antybiotyk; metoda dyfuzyjna z zastosowanie E-testu – jest to plastikowy pasek nasączony antybiotykiem w gradiencie stężeń, który umożliwia określenie najniższego stężenia hamującego wzrost (MIC – minimal inhibitory concentration).

Obecnie, w praktyce klinicznej manualne metody bezpośrednie ustępują miejsca systemom automatycznym, które pozwalają na skrócenie czasu analizy, dokładniejszą identyfikację szczepu oraz ocenę lekowrażliwości.

W przypadku, gdy hodowla danego patogenu jest niemożliwa lub też utrudniona, stosowane są nowoczesne metody, pozwalające wykazać obecność swoistych składowych dla danego czynnika chorobotwórczego. Należą do nich:
 
- metody immunologiczne pozwalające wykryć obecność charakterystycznych antygenów przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Zajście reakcji antygen-przeciwciało widoczne jest w postaci aglutynacji, precypitacji, luminescencji lub też immunofluorescencji w badanej próbce.

- Sondy molekularne.
 
- metody amplifikacji kwasów nukleinowych (PCR, RT-PCR).

2. Metody pośrednie – polegające na serologicznym wykazaniu obecności przeciwciał. Należą do nich metoda aglutynacji, immunoprecypitacji, odczyn wiązania dopełniacza, metoda radioimmunologiczna (RIA), test ELISA (test immunoenzymatyczny), metoda immunofluorescencyjna czy też test hamowania hemaglutynacji. Ilościowe określenie zapisane jest w formie miana, czyli ostatniego rozcieńczenia surowicy, w którym zaszła jeszcze reakcja dodatnia. Stwierdzenie obecności swoistych przeciwciał wymagane jest w sytuacji trudności lub też niemożności wykazania bezpośredniej przyczyny infekcji, bądź dłuższego trwania choroby.

Badania aktywności nowych związków przeciwdrobnoustrojowych
Szybka i prawidłowa diagnostyka pozwala lekarzowi na wdrożenie odpowiednich procedur terapeutycznych. Niemniej, coraz częściej spotykana oporność bakterii na stosowane antybiotyki lub chemioterapeutyki zmusza do poszukiwania nowych substancji o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Badania dotyczą projektowania związków o odmiennych mechanizmach antybakteryjnych, nie wywołujących oporności, przy jednoczesnym niskim stopniu toksyczności w stosunku do komórek ludzkich. W praktyce laboratoryjnej, ze względu na relatywnie niski koszt badania dominują metody manualne. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) jest instytucją, która zajmuje się opracowywaniem referencyjnych metod laboratoryjnychjjkj, w tym między innymi badania lekowrażliwości. Wśród nich wyróżnić należy badanie:

- Najniższego stężenia hamującego wzrost (MIC) – metoda mikrorozcieńczeń w bulionie (ang. microbroth dilution method) na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. W metodzie tej do gradientu stężeń badanej substancji, sporządzonego w określonej pożywce mikrobiologicznej dodaje się odpowiedniej ilości zawiesiny drobnoustrojów. W próbie uwzględniona musi być również kontrola dodatnia (kontrola wzrostu drobnoustrojów) – oraz kontrola ujemna (kontrola jałowości). Czas uzyskania wyników, w zależności od rodzaju badanego szczepu może wynosić od 18 do 72 godzin. Za stężenie MIC przyjmuje się takie stężenie, przy którym nie jest obserwowany widoczny wzrost drobnoustrojów.

- Najniższego stężenia bakteriobójczego (MBC, ang. Minimal bactericidal concentration). W próbie tej, bezpośrednio po badaniu MIC, na płytkę ze stałym podłożem agarowym nanosi się niewielkie objętości z dołków z serii rozcieńczeń badanej substancji. Za stężenie MBC przyjmuje się najniższe stężenie, przy którym nie obserwuje się wzrostu kolonii bakteryjnych po odpowiednim czasie inkubacji.  

Biofilm
Równolegle z badaniami nad nowymi substancjami przeciwdrobnoustrojowymi badacze koncentrują się również nad poznaniem fizjologii bakterii, a także zdolnością do wywoływania infekcji. Naukowcy coraz częściej zwracają uwagę na zjawisko formowania się biofilmu przez drobnoustroje. Biofilm jest to dynamiczna, wielokomórkowa struktura, złożona z wielu warstw mikroorganizmów, przytwierdzonych do powierzchni. Zbudowana jest z uporządkowanych agregatów komórek, otoczonych produkowaną przez nie zewnątrzkomórkową macierzą (EPS – ang. extracellular polymeric substances), utworzoną z polisacharydów, białek i lipidów. Szacuje się, że większość zakażeń bakteryjnych u ludzi związana może być z obecnością biofilmu. Ponadto niektóre drobnoustroje mogą tworzyć tę strukturę na powierzchni materiałów medycznych takich jak cewniki, implanty czy zastawki, co skutkować może rozwojem zakażeń bezpośrednio po implantacji. Ponadto ta swoista mikrobiologiczna „społeczność”, ze względu na obecność EPS oraz odmienną fizjologię wśród tworzących ją drobnoustrojów, wykazuje znaczną oporność na antybiotyki. Naukowcy często podkreślają znaczącą rolę obecności biofilmu w przypadku trudno wyleczalnych, nawracających infekcji, a także jego udziału w przenoszeniu genów oporności wśród drobnoustrojów. Dlatego przy badaniach nad nowymi substancjami przeciwbakteryjnymi ujmowane są również testy wobec biofilmu. W literaturze spotykany jest termin MBEC (ang. minimal biofilm eradication/eliminating concentration) – minimalne stężenie eliminujące biofilm. Na chwilę obecną, w związku z tym, że struktura ta nie jest do końca poznana, to też nie ma ściśle określonych referencyjnych metod hodowli i badania biofilmu. W literaturze spotykany jest szereg badań obejmujących zarówno metody spektrofotometryczne, kolorymetryczne, mikroskopowe (mikroskopia fluorescencyjna, konfokalna, elektronowa, X-ray), metody biologii molekularnej (PCR, qRT-PCR, FISH) czy też badania z zastosowaniem spektrometrii mas. Niejednokrotnie wspominany jest również temat biofilmu przy pracach badawczych związanych z „lab-on-a-chip”. Zagadnienie to za względu na tak rozbudowany charakter stanowi olbrzymi,
a zarazem niezwykły niezwykły poligon doświadczalny dla obecnych i przyszłych badań naukowców.


Piśmiennictwo:

1. B. Neumeister, I. Besenthal, B.O. Böhm: Diagnostyka laboratoryjna - poradnik kliniczny. Elsevier Urban & Partner. Wrocław 2013.

2. P. Gajewski, A. Szczeklik: Interna Szczeklika 2013. Podręcznik chorób wewnętrznych. Medycyna Praktyczna. Kraków, 2013.

3. V. Lorian, Antibiotics In Laboratory Medicine, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

4. Nikolaev YuA, Plakunov V.K.: Biofilm-“City of microbes” or an analogue of multicellular organisms? Microbiol. 2007, 76(2), 125-138.

5. Archer N.K., Costerton W.J., Leid J.G, Mazaitis M.J., Powers M.E., Shirtliff M.E.: Staphylococcus aureus biofilms. Properties, regulation and roles in human disease. Virulence. 2011, 2(5), 445-459.

6. Pantanella F., Valenti P., Natalizi T., Passeri D., Berlutti F.: Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann Ig 2013; 25: 31-42.