Dorian Migoń, Wojciech Kamysz
Gdański Uniwersytet Medyczny



Współczesna farmakopea jest pozycją zawierającą podstawowe wymagania jakościowe dla substancji czynnych i substancji pomocniczych oraz metody badań produktów leczniczych i ich opakowań. Według ustawy z dnia 6 września 2001 r. Prawo farmaceutyczne farmakopeą obowiązującą w Polsce jest Farmakopea Europejska lub Farmakopea Polska, która jest jej bezpośrednim tłumaczeniem na język polski wzbogaconym o działy narodowe. Spełnienie stawianych w niej wymogów jakości jest niezbędne, aby wytwórca produktów leczniczych mógł wprowadzić dany preparat na polski rynek.

Ze względu na swoją małą biodostępność po podaniu doustnym i niską stabilność peptydy przez lata były traktowane jako niezbyt obiecujący kandydaci na leki. Gwałtowny postęp technologii formulacyjnych leków peptydowych na przestrzeni ostatnich dwóch dekad (tj. alternatywne drogi podania, substancje pomocnicze zwiększające ich stabilność, modyfikacje molekuły zwiększające okres biologicznego półtrwania itp.) doprowadziły do odrodzenia i intensywnego rozwoju tej grupy leków. Peptydy, zaraz obok leków małocząsteczkowych i leków biologicznych, stanowią jeden z głównych kierunków rozwoju współczesnego rynku farmaceutycznego. Obecnie na świecie zarejestrowanych jest około 70 leków peptydowych. Dodatkowo, ponad 140 jest aktualnie w trakcie badań klinicznych, zaś kolejne 500 w trakcie badań przedklinicznych. Z powodu mnogości możliwych kombinacji sekwencji reszt aminokwasowych, peptydy znajdują potencjalne zastosowanie w wielu stanach chorobowych. Są one badane między innymi pod kątem ich użyteczności w chorobach sercowo-naczyniowych, nowotworowych, zakaźnych, cukrzycy czy otyłości.

Patrząc przez pryzmat budowy chemicznej, peptydy plasują się między lekami małocząsteczkowymi, a wielkocząsteczkowymi lekami białkowymi. Mimo to, regulacyjnie nie są traktowane jako odrębna grupa. W zależności od metody ich otrzymania (synteza chemiczna, fermentacja, ekstrakcja z tkanek czy inżynieria genetyczna) i właściwości (głównie długość łańcucha) są traktowane przy rejestracji danego leku jako lek biologiczny albo lek konwencjonalny. Agencja Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration, FDA) definiuje syntetyczny polipeptyd jako polimer alfa aminokwasów, który jest otrzymany całkowicie za pomocą syntezy chemicznej i posiada mniej niż 100 reszt aminokwasowych w swojej sekwencji. Europejska Dyrekcja Jakości Leków (ang. European Directorate for the Qualiy of Medicines, EDQM) za syntetyczny peptyd postrzega taki, który został otrzymany drogą syntezy chemicznej i ma zazwyczaj poniżej 5000 Da. Z tego wynika, że syntetyczne peptydy jako grupa związków są niesamowicie różnorodne, nie tylko pod względem aktywności biologicznej, ale także wielkości. Powoduje to, że normy jakości dotyczące peptydowych substancji leczniczych muszą obejmować związki posiadające od 2 do nawet 99 reszt aminokwasowych.

W aktualnej Farmakopei Polskiej X (FP X) opisanych jest 11 peptydów otrzymanych drogą syntezy chemicznej (Tabela 1).


Tabela 1 Peptydy otrzymane drogą syntezy chemicznej opisane w Farmakopei Polskiej X.



W monografiach szczegółowych wymagania jakościowe dla każdego z peptydów składają się z trzech głównych części:
  • Tożsamość
  • Badania
  • Zawartość
Tożsamość
Badanie to ma na celu potwierdzenie, że dana substancja odpowiada substancji zadeklarowanej w nazwie. Zasadniczo, stosowane techniki i metody analityczne powinny być w stanie rozróżnić substancję badaną od tych posiadających zbliżoną budowę chemiczną. Zazwyczaj tożsamość peptydu potwierdzana jest za pomocą dwóch ortogonalnych pomiarów analitycznych. Wyjątkiem jest leuprorelina, gdzie FP X wymaga trzech badań.

HPLC-UV
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) w odwróconym układzie faz z detektorem spektrofotometrycznym jest najczęściej stosowaną techniką analityczną do potwierdzania tożsamości badanego peptydu (wymieniona jest we wszystkich monografiach). Potwierdzenie tożsamości badanej substancji następuje poprzez porównanie czasu retencji głównego piku chromatogramu roztworu badanego z czasem retencji głównego piku chromatogramu roztworu chemicznej substancji porównawczej (CSP). Każda z metod chromatograficznych została opracowana prawdopodobnie niezależnie, z tego powodu brak jest jednolitości pomiędzy między poszczególnymi monografiami (np. w składnie faz ruchomych). Co ciekawe, tylko monografie nowsze (tj. goserelina i somatostatyna) wykorzystują jako modyfikator fazy ruchomej kwas trifluorooctowy, który jest obecnie ‘złotym standardem’ jeśli chodzi o analizę peptydów za pomocą HPLC-UV.

Analiza aminokwasów
Analiza aminokwasów jest metodą analityczną zalecaną do potwierdzenia tożsamości prawie wszystkich farmakopealnych syntetycznych peptydów (oprócz gonadoreliny i protyreliny). Bazuje ona na ilościowej analizie chromatograficznej próbki peptydu poddanej hydrolizie do aminokwasów i często derywatyzacji. Zawartość aminokwasów w badanej próbce jest wyznaczana poprzez zastosowanie krzywej kalibracyjnej. Potwierdzenie tożsamości następuje, gdy względna proporcja każdego z wymienionych w monografii aminokwasów znajduje się w obrębie przedstawionych wartości granicznych. Przykładowo dla busereliny: obliczana jest średnia molowa zawartość aminokwasów: kwasu glutaminowego, histydyny, tyrozyny, leucyny, argininy i proliny. Proporcja aminokwasów względem tej średniej wartości powinna wynosić kolejno: seryna od 1,4 do 2,0; prolina od 0,8 do 1,2; kwas glutaminowy od 0,9 do 1,1; leucyna od 0,9 do 1,1; tyrozyna od 0,9 do 1,1; histydyna od 0,9 do 1,1; arginina od 0,9 do 1,1. Pozostałe aminokwasy powinny występować w ilościach śladowych.

1H NMR
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego jest proponowana przez FP X do badania tożsamości peptydu tylko w dwóch monografiach (burserelina i goserelina). Identyfikacja, w tym przypadku, nie polega na interpretacji widma badanej próbki lecz na porównaniu jej w tych samych warunkach z widmem próbki CSP. Ważne jest, aby określić sygnały pochodzące od zanieczyszczeń. Wpływają one na różnice między widmami próbek, pomimo że mogą nie być istotne dla jakości peptydu. Ze względu na zbyt niską rozdzielczość widm większych peptydów, badanie to jest ograniczone tylko do tych związków, które posiadają do 15 reszt aminokwasowych w sekwencji.

Spektrofotometria IR
Absorpcyjna spektrofotometria w podczerwieni, podobnie jak NMR, jest proponowana przez FP X do badania tożsamości peptydu w dwóch monografiach (leuprorelina i protyrelina). Potwierdzenie tożsamości również polega na porównaniu widm próbki badanej i CSP.

TLC
Chromatografia cienkowarstwowa jest techniką analityczną zalecaną tylko w jednej monografii (Gonadoreliny octan). Potwierdzenie tożsamości następuje, gdy plamy główne na płytce TLC dla próbki badanej i próbki CSP posiadają to samo położenie i tą samą wielkość.

Badania
Pod nazwą „badania” figurują różnorodne techniki i metody analityczne stosowane w celu charakteryzacji peptydów między innymi pod kątem ich zanieczyszczeń, właściwości fizykochemicznych czy obecności endotoksyn bakteryjnych.

Substancje pokrewne
Ze względu na wieloetapowość chemicznej syntezy peptydów związki te, w przeciwieństwie do leków małocząsteczkowych, charakteryzują się duża różnorodnością potencjalnych zanieczyszczeń. We wszystkich monografiach techniką zalecaną do badania substancji pokrewnych jest wysokosprawna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz z detekcją UV. Dodatkowo, dla dwóch zanieczyszczeń w przypadku kalcytoniny łososiowej zalecana jest chromatografia jonowymienna. Limity dla sumy i pojedynczych zanieczyszczeń są różnorodne. Przykładowo, limity dla sumy zanieczyszczeń rozciągają się od 1,5% (desmopresyna) do 9% (tetrakozaktyd). Z drugiej strony, progi dla wykazywania, identyfikacji i kwalifikacji pojedynczych zanieczyszczeń organicznych przedstawione w monografii ogólnej Corpora ad usum pharmaceuticum są jednolite dla wszystkich peptydów otrzymanych drogą syntezy chemicznej i wynoszą kolejno 0,1 %, 0,5% i 1,0%. Oczywiście dla zanieczyszczeń o udowodnionej silnej lub toksycznej aktywności te limity powinny być odpowiednio mniejsze. Ocena zawartość zanieczyszczeń jest przeprowadzana na dwa sposoby: metodą normalizacji wewnętrznej (6 monografii) lub poprzez porównanie pola powierzchni piku zanieczyszczenia do pola powierzchni piku (lub jego wielokrotności) powstałego w wyniku rozcieńczenia roztworu porównawczego do wartości granicznej, np. 1% (5 monografii).

Skręcalność optyczna właściwa
Badanie skręcalności optycznej właściwej jest zalecane we wszystkich monografiach z wyjątkiem kalcytoniny łososiowej i oksytocyny. Wykonywane jest za pomocą polarymetru w temperaturze 20 °C (z wyjątkiem felipresyny dla której wymagane jest 25 °C). Wszystkie pomiary wykonywane są w przeliczeniu na substancję bezwodną i wolną od kwasu octowego. Zalecane stężenia są zależne od peptydu i wynoszą 2 lub 10 g/L. Przedziały akceptacji dla skręcalności optycznej właściwej różnią się w zależności od monografii i wynoszą od ±2 do ±6.

Kwas octowy
Wszystkie syntetyczne peptydy opisane w FP X występują w formie soli octanowej. Octany w badanych peptydach, oprócz w charakterze przeciwjonów, mogą występować także w formie kwasu octowego jako zanieczyszczenie. Monografia ogólna Kwas octowy w syntetycznych peptydach do oznaczenia zawartości kwasu octowego w próbce zaleca wykorzystanie techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz. Przedziały akceptacji są zależne od masy peptydu oraz obecności zasadowych reszt aminokwasowych w jego sekwencji (np. lizyna, arginina). Akceptowalne zakresy zawartości kwasu octowego w próbce zostały zaprezentowane w tabeli 2.


Tabela 2 Akceptowalne zawartości kwasu octowego i wody w próbkach peptydów opisanych w FP X.



Woda
Do oznaczania zawartości wody w syntetycznych peptydach FP X zaleca dwie metody miareczkowania. Pierwsza, opisana w monografii ogólnej Woda - oznaczanie w skali półmikro bazuje na miareczkowaniu amperometrycznym i jest zalecana dla 4 syntetycznych peptydów. Druga, zalecana do pozostałych peptydów, opisana jest w monografiiogólnej Woda - oznaczanie w skali mikro i polega na miareczkowaniu kulometrycznym. Limit zawartości wody w próbce peptydu został przedstawiony w tabeli 2.

Wygląd roztworu
Badanie wyglądu roztworu jest wymagane w trzech monografiach syntetycznych peptydów. Polega ono na wizualnej ocenie roztworu peptydu o stężeniu 10 g/L pod kątem jego przezroczystości (badanie opisane w monografii ogólnej – Przezroczystość i stopień zmętnienia płynów) oraz intensywności zabarwienia (nie bardziej niż roztwór porównawczy Ż7 na bazie monografii ogólnej Stopień zabarwienia płynów).

Absorbancja i absorbancja właściwa
Badanie absorbancji w nadfiolecie jest opisane w monografiach busereliny, octanu gonadoreliny i tetrkozaktydu. Ze względu na to, że wszystkie te peptydy zawierają w swojej sekwencji resztę tryptofanu, pomiary są prowadzone przy długości fali zbliżonej do 280 nm (278 nm dla busereliny i octanu gonadoreliny i 276 nm dla tetrakozaktydu). Przedziały akceptacji dla wyników absorbancji wynoszą od ±3% do ±5%. Dodatkowo, w przypadku badania tetrakozaktydu podane jest wymaganie dotyczące odpowiedniego stosunku absorbancji przy długości fali 276 nm do absorbancji przy długości fali 248 nm.

Aminokwasy
Analiza aminokwasowa, występująca dla reszty peptydów w dziale Tożsamość, dla octanu gonadoreliny została opisana w dziale Badania. Dodatkowo, nie odnosi się do monografii ogólnej Analiza aminokwasów oraz odgórnie zakłada użycie analizatora aminokwasów i norleucyny jako wzorca wewnętrznego.

Popiół siarczanowy
Badanie popiołu siarczanowego zostało opisane tylko w jednej monografii (leuprorelina). Badanie to jest opisane w monografii ogólnej Popiół siarczanowy i polega na porównaniu masy próbki przed i po mineralizacji na mokro z kwasem siarkowym.

pH
Badanie pH jest w FP X wymagane tylko dla oksytocyny. Zakłada ono pomiar pH roztworu oksytocyny o stężeniu 20 g/L metodą potencjometryczną.

Endotoksyny bakteryjne
Badanie endotoksyn bakteryjnych jest wymagane dla wszystkich substancji przeznaczonych do wytwarzania preparatów pozajelitowych, w których nie została wprowadzona procedura pozwalająca na ich usunięcie. Badanie polega na oznaczeniu zawartości endotoksyn bakteryjnych za pomocą testu LAL (Limulus Amebocyte Lysate) i jest opisane w monografii ogólnej Endotoksyny bakteryjne. Przedziały akceptacji dla zawartości endotoksyn bakteryjnych wynoszą od 0,7 IU/mg (protyrelina) do 500 IU/mg (desmopresyna).

Pozostałość rozpuszczalników
Badanie pozostałości rozpuszczalników zostało opisane w Corpora ad usum pharmaceuticum jako wymagane dla wszystkich substancji do celów farmaceutycznych. Zalecana metoda, odpowiednia dla większości rozpuszczalników, jest opisana w monografii ogólnej Identyfikacja i kontrola pozostałości rozpuszczalników i wykorzystuje technikę chromatografii gazowej z dozownikiem typu head-space. Z kolei limity zawartości poszczególnych rozpuszczalników są wymienione w rozdziale Pozostałość rozpuszczalników. Co ciekawe, kwas trifluorooctowy, używany w syntezie peptydów między innymi do odszczepiania od żywicy, znajduje się w kategorii rozpuszczalników o niewystarczająco poznanej toksyczności i takiego limitu nie ma. FP X pozostawia jego opracowanie i uzasadnienie wytwórcy.

Jakość mikrobiologiczna/ Jałowość
Badania jakości mikrobiologicznej i jałowości to kolejne badania które pojawiły się w monografii ogólnej Corpora ad usum pharmaceuticum i są wymagane dla wszystkich substancji do celów farmaceutycznych. W zależności od tego czy peptyd ma służyć do wytwarzania jałowej lub niejałowej postaci leku musi spełniać odpowiednie wymagania co do czystości mikrobiologicznej. Syntetyczny peptyd określony jako jałowy musi spełniać kryteria zamieszczone w monografii ogólnej Jałowość. Wymagania co do czystości peptydu określonego jako niejałowy są zależne od docelowej postaci leku i zostały zamieszczone w rozdziale Mikrobiologiczna jakość niejałowych preparatów farmaceutycznych i substancji do celów farmaceutycznych.

Zawartość
Dla wszystkich 11 syntetycznych peptydów opisanych w FP X do oznaczenia zawartości substancji zalecana jest technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz. Oznaczenie ilościowe następuje poprzez porównanie pola powierzchni piku badanej substancji z polem powierzchni CSP w której zawartość peptydu jest zadeklarowana. Dopuszczalne zawartości peptydu są różne i zależą od jego masy cząsteczkowej, możliwych zanieczyszczeń i powtarzalności metody analitycznej. Najszerszym akceptowalnym kryterium zawartości charakteryzowała się kalcytonina łososiowa (90,0% - 105,0%), zaś najwęższym protyrelina (97,0% - 102,0%).

Przyszłość
Ocena jakości leków peptydowych, głównie ze względu na ich różnorodność budowy, stanowi szczególne wyzwanie dla wytwórcy. W celu odpowiedniej charakteryzacji syntetycznego peptydu niezbędne jest poddanie go wielu badaniom pozwalającym ustalić między innymi jego tożsamość, czystość, właściwości fizykochemiczne i zawartość. Farmakopea, jako pozycja określająca podstawowe wymagania jakościowe substancji leczniczych, powinna rekomendować najbardziej współczesne techniki i metody analityczne. Mimo to, niektóre monografie syntetycznych peptydów wciąż zawierają przestarzałe metody lub techniki analityczne. Przykładowo, jedną z zalecanych metod identyfikacji octanu gonadoreliny jest wciąż analiza TLC. Technika ta, pomimo że użyteczna do szybkiej analizy na przykład w chemii organicznej, ze względu na słabą możliwość automatyzacji i niską powtarzalność w przemyśle farmaceutycznym jest powoli zastępowana przez inne techniki chromatograficzne. Możliwe, że i w tym przypadku w kolejnym wydaniu Farmakopei Polskiej badanie to zostanie zastąpione przez inne metody potwierdzenia tożsamości peptydu: Analizę aminokwasów lub technikę NMR. Kolejnym przykładem badania, którego przydatność jest poddawana debatom może być badanie skręcalności optycznej próbki peptydu. Ze względu na dosyć duże zakresy akceptacji, niską czułość oraz fakt, że zanieczyszczenia diastereoizomeryczne są wykazywane za pomocą badania substancje pokrewne, obecność skręcalność optyczna właściwa w monografiach wynika raczej ze względów historycznych niż przesłanek naukowych. Z tego powodu, istnieje szansa, że w przyszłości badanie to zostanie zastąpione czulszą i bardziej powtarzalną techniką chromatografii chiralnej.

Zastanawiający jest brak w monografiach syntetycznych peptydów FP X jakichkolwiek badań wykorzystujących spektrometrię mas (MS). Analiza peptydów pod kątem ich struktury pierwszorzędowej za pomocą MS jest znana i rutynowo stosowana w laboratoriach peptydowych. Dodatkowo, sprzężenie detektora mas z chromatografią cieczową umożliwiłoby łatwiejszą i szybszą identyfikację zanieczyszczeń w badaniu substancje pokrewne. Niestety, taka aplikacja wymagałaby również opracowania nowych metod do profilowania zanieczyszczeń peptydów, ponieważ większość faz ruchomych przedstawionych w monografiach jest niekompatybilna z detektorem mas. W Farmakopei Amerykańskiej, w przeciwieństwie do Farmakopei Europejskiej, w badaniach tożsamości peptydów występuje analiza wykorzystująca MS, nie występuje zaś NMR. Jest to podejście przystępniejsze dla laboratoriów kontroli jakości specjalizujących się w syntetycznych peptydach z tego względu, że aparatura MS jest zazwyczaj znacznie tańsza i bardziej uniwersalna niż NMR. Obserwowane na przestrzeni ostatnich lat dążenie do ujednolicenia wytycznych farmakopealnych na całym świecie oraz dalszy rozwój spektrometrii mas, może w przyszłości doprowadzić do rozszerzenia badań syntetycznych peptydów występujących w Farmakopei Polskiej o tę technikę.

Zanieczyszczenia wielkocząsteczkowe mogą powstawać w peptydach na drodze syntezy chemicznej, na drodze agregacji lub samoasocjacji. Charakteryzacja peptydów pod względem występowania tych zanieczyszczeń jest zazwyczaj prowadzona dopiero przy badaniach postaci leku. Mimo to, już na poziomie substancji leczniczej możliwa jest obecność dimerów lub agregatów wyższego rzędu powstałych przez wiązanie kowalencyjne (na przykład przez mostek disiarczkowy lub dityrozynę) oraz agregatów nieodwracalnych powstałych przez wiązanie niekowalencyjne. Zanieczyszczenia te mogą mieć duży wpływ na późniejszą aktywność farmakologiczną, toksyczność oraz stabilność produktu leczniczego. FP X tylko w przypadku felipresyny identyfikuje część możliwie powstałych zanieczyszczeń w badaniu substancje pokrewne jako dimery połączone wiązaniem kowalencyjnym. Ich obecność może zostać potwierdzona techniką HPLC w odwróconym układzie faz. Z drugiej strony, FP X nie opisuje żadnych technik lub metod pozwalających ocenić syntetyczny peptyd pod względem zanieczyszczeń będących agregatami wyższego rzędu. Wzbogacenie badania substancje pokrewne o dodatkową analizę syntetycznego peptydu na przykład za pomocą techniki chromatografii wykluczania pozwoliłaby na ocenę próbki także pod względem zanieczyszczeń wielkocząsteczkowych.

Podsumowanie
Monografie syntetycznych peptydów opisane w FP X charakteryzują się częściową różnorodnością badań wymaganych do oceny ich jakości (tabela 3).


Tabela 3 Zestawienie badań wymaganych do charakteryzacji syntetycznych peptydów w Farmakopei Polskiej X.



Harmonizacja pomiędzy poszczególnymi monografiami i wzbogacenie ich o nowoczesne techniki analityczne znacząco pomogłaby w rozwoju oraz zoptymalizowałaby pracę firm farmaceutycznych specjalizujących się w związkach peptydowych.


PIŚMIENNICTWO:

  • Farmakopea Polska X, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa, 2014.
  • K. Fosgerau, T. Hoffmann, Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today, 20 (2015) 122-128.
  • R. Lax, Redefining the peptide therapeutics manufacturing industry in the 21st century (Part 1) Status and outlook in 2016,ChimicaOggi – Chemistry Today, 34(2016) 64-72.
  • V. Vergote, C. Burvenich, C. Van de Wiele, B. De Spiegeleer, Quality specifications for peptide drugs: a regulatory-pharmaceutical approach, J. Pept. Sci. 15 (2009) 697-710.
  • Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product: Guidance for industry, U.S. Food and Drug Administration, 2015.
  • Guide for the elaboration of monographs on synthetic peptides and recombinant DNA proteins, European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare, 2010.