– technika do separacji i charakterystyki: białek, cząstek i polimerów

Kees de Ruijter, Stepan Podzimek, Thomas Jocks,
Wyatt Technology Europe GmbH, Dernbach, Niemcy
strony wersji drukowanej: 18-21






Frakcjonowanie przepływowe w asymetrycznym polu sił przepływu (Asymmetric flow field flow fractionation; A4F) jako jeden z typów frakcjonowania przepływowego w polu sił (FFF) współistnieje obok chromatografii żelowej (SEC) od kilku dziesięcioleci. Jednakże, zwłaszcza we wczesnych publikacjach, wiele z opublikowanych fraktogramów FFF nie mogło naprawdę wykazać, że FFF to dojrzała technika do rutynowych zastosowań.

W ostatnich latach sytuacja zupełnie się zmieniła. Nowa generacja dostępnych komercyjnie instrumentów AF4 daje szerokie możliwości rozdzielania różnorodnych białek, cząstek, agregatów, mikrosfer czy polimerów. Co więcej technika ta posiada szereg korzyści w porównaniu do tradycyjnie stosowanych metod SEC. Zalety te to: szeroki zakres rozdziału, zmniejszone ryzyko degradacji przez ścinanie, brak oddziaływań molekularnych z materiałem wypełniającympróbki (co jest nieodzowne dla próbek, które można przygotowywać tylko w niskich stężeniach) oraz szereg innych.

Podstawowe zasady rozdziału za pomocą AF4
Frakcjonowanie przepływowe w asymetrycznym polu sił przepływu (AF4) jest niedestruktywną, jednofazową techniką do rozdzielania makromolekuł w roztworze. Jest ono stosowane do separacji białek, biopolimerów i cząstek. W AF4 wymywanie składników przy określonych czasach retencji związane jest z promieniami hydrodynamicznymi rozdzielanych molekuł. Podobnie jest również w SEC, ale w chromatografii żelowej wymagana jest kalibracja za pomocą standardów, aby wyznaczyć zależność pomiędzy czasem retencji i wielkością. FFF umożliwia przewidywanie retencji danego składnika lub wyliczenie rozmiaru hydrodynamicznego bezpośrednio ze znanego równania retencji a wynik obliczenia to średnica Stokes’a. Równanie retencji jest spełnione tylko przy braku oddziaływań. Frakcjonowanie zachodzi w kanale, który składa się z dwóch płytek, rozdzielonych przez przekładkę dystansującą z tworzywa sztucznego (ang. spacer foil); płytki są złączone razem (Rys. 1).


Rys. 1. Zasada frakcjonowania przepływowego w asymetrycznym polu sił przepływu.


Górna płytka kanału jest nieprzepuszczalna, natomiast dolna jest przepuszczalna – wykonana z porowatego materiału. Membrana ultrafiltracyjna pokrywa dolną płytkę zapobiegając wydostaniu się próbki z kanału. Proces rozdziału może być podzielony na trzy etapy: nastrzyk, ogniskowanie i elucja. W pierwszych dwóch etapach przepływ główny jest rozdzielony, wchodzi do kanału z obydwu końców i wydostaje się dolną porowatą ścianą. Strumienie są tak równoważone, że spotykają sie pod portem nastrzykowym.

Po nastrzyknięciu, próbka jest ogniskowana w wąskim paśmie poniżej portu nastrzykowego i zatężana w kierunku membrany. Przepływ przechodzący przez dolną ścianę przesuwa składniki w stronę granic kanału (,,ściana akumulacji”). Dyfuzja związana z ruchami Browna wytwarza przeciwstawny ruch: małe cząstki, które mają na ogół większe współczynniki dyfuzji, zajmują położenie równowagowe najdalej od ściany akumulacji. Ten etap ogniskowania zajmuje typowo jedną minutę.

W fazie elucji, po ustaleniu równowagi zgodnie z wielkością molekuł w fazie ogniskowania, składniki próbki opuszczają kanał, poruszając się zgodnie z parabolicznym rozkładem, który przenosi cząsteczki z różnymi prędkościami, dzięki czemu ulegają rozdziałowi. Mniejsze cząstki wymywane są przed większymi, dokładnie w odwrotnej kolejności niż w rozdziale za pomocą chromatografii żelowej (SEC/GPC). Proces ten jest szybki i nie niszczący a próbka nie ulega zmianom powodowanym przez fazę stacjonarną.

W porównaniu do chomatografii żelowej ,AF4 wykazuje znacznie większą selektywność, co daje szerszy możliwy zakres zastosowań.

Wielokątowe rozpraszanie światła (MALS)
Detekcja za pomocą MALS daje masy cząsteczkowe i promienie składników próbki rozdzielonych za pomocą AF4. Wyniki tych pomiarów są wartościami bezwzględnymi, ponieważ ich wyznaczenie jest przeprowadzane z zastosowaniem rozpraszania światła i praw fizyki. Nie są potrzebne standardy mas cząsteczkowych, ani przyjmowanie jakichkolwiek dodatkowych założeń. Wielkość cząsteczki jest obliczana z zależności kątowej intensywnośći rozpraszania światła. Jeżeli instrument dokonuje pomiaru tylko pod jednym kątem, zależność kątowa rozpraszanego światła laserowego nie może być wyznaczona. Tylko detektory wielokątowego rozpraszania światła mogą być stosowane do bezpośredniego wyznaczania wielkości cząsteczek. Instrumenty MALS wymagają rozmieszczenia fotodiod w dość szerokim zakresie kątów rozpraszania. Co więcej, wysoka czułość jest bardzo istotna ze względu na nadzwyczaj niskie stężenia w celce instrumentu, które są typowe dla tego typu pomiarów. Zatem możliwe jest tylko małe załadowanie próbki, która jest dodatkowo rozcieńczana w trakcie rozdziału. Niezbędny jest również wysoki zakres dynamiczny detekcji. Przy małych kątach intensywność rozpraszania może o kilka rzędów wielkości przewyższać rozpraszanie przy większych kątach, a wszystkie sygnały muszą być jednocześnie rejestrowane z wysokim stosunkiem sygnału do szumu.

Istnieją dwa rodzaje promieni, które można wyznaczyć za pomocą pomiarów rozpraszania światła: jeden promień to tzw. średnia kwadratowa promienia (Root Mean Square Radius, RMS, zwany również promieniem żyracji) lub rg, który jest średnią ważoną odległością każdego punktu masy od środka ciężkości. Rg jest wrażliwy na rozkład masy cząsteczkowej molekuły lub cząstki.

Drugi promień to promień hydrodynamiczny, który jest definiowany jako promień chaotycznie rotującej cząsteczki (we wszystkich kierunkach) wraz z jej sferą hydratacyjną. W zasadzie jest on miarą podatności przemieszczenia cząsteczki w rozpuszczalniku.

Stosunek rg do rh daje cenną dodatkową informację odnośnie kształtu badanych cząsteczek.

Rys. 2. Schemat głowicy pomiarowej do pomiarów rozpraszania pod wieloma kątami.

 
Zastosowania
Poniżej przedstawionych będzie kilka przykładów rozdzielania zapomocą AF4 i charakterystyki za pomocą MALS.

Wykrywanie powstawania agregatów w preparatach przeciwciał
Przeciwciała odgrywają rosnącą rolę jako czynniki terapeutyczne, ponieważ mogą być stosowane jako immunologicznie czynne ,,magiczne kule” w coraz większej liczbie chorób. Niestety przeciwciała mają tendencję do tworzenia dimerów, kompleksów i dużych agregatów, które mogą powodować poważne komplikacje, jeśli są w sposób niekontrolowany stosowane jako terapeutyki. Prowadzi to do nieuniknionej konieczności kontroli jakości i precyzyjnej ich charakterystyki.

Stosując AF4 i MALS można dokładnie wyznaczyć czystość i skład roztworu przeciwciał. Rys. 3 pokazuje wpływ stresu termicznego na preparat przeciwciał. Natywne przeciwciało prawie wyłącznie składa się z monomerów, natomiast poddany stresowi termicznemu roztwór wykazuje znaczącą agregację, gdyż tworzą się kompleksy o masach cząsteczkowych sięgających 109 Daltona.


Rys. 3. Porównanie rozdziału dwóch preparatów przeciwciał; natywne białko (niebieski) i poddane stresowi (czerwony), który spowodował utworzenie oligomerów o masach w zakresie do 109 Da.


Charakterystyka cząstek wirusopodobnych
Cząstki wirusów często służą jako narzędzie do budowania i transportu pęcherzyków, które mogą być wypełnione terapeutykami lub immunostymulantami. Takie zawiesiny wirusowe muszą być dokładnie scharakteryzowane, aby uniknąć niepożądanych efektów immunologicznych lub nawet efektu toksycznego.

Rys. 4 przedstawia oznaczenie dwóch różnych szczepów wirusów; wykreślono zależność promieni RMS względem czasu elucji. Możliwe było rozdzielenie dwóch populacji tylko nieznacznie różniących się wielkością: 16 i 18,5 nm.


Rys. 4. Porownanie dwoch cz.stek wirusopodobnych (promie. RMS wzgl.dem czasu elucji). Nastrzyk 1 ƒĘl roztworu o st..eniu 2,3 mg/ml . rozdzia. za pomoc. AF4, detekcja MALS + UV.


Podsumowanie
AF4 jest niedestruktywną techniką separacyjną dla białek, cząstek i polimerów. W niektórych przypadkach jest alternatywą dla SEC, zwłaszcza przy analizie dużych molekuł. Sprzężenie tej techniki z wielokątowym rozpraszaniem światła daje najnowocześniejszy system do wszechstronnej charakterystyki makromolekularnej. Rys. 5 przedstawia połączenie systemu FFFF (Eclipse DUALTEC), detektora rozpraszania światła (DAWN Heleos II) i detektora stężeniowego (Optilab TrEX) w połączenu z chromatografiem cieczowym, tworzące razem najbardziej nowoczesny system do rozdzielania i charakterystyki makromolekularnej.


Rys. 5. Typowa konfiguracja Wyatt’a do najbardziej wszechstronnej charakterystyki makromolekuł i cząstek.


Piśmiennictwo:

1. K.-G. Wahlund, A. Litzen: J. Chromatogr. 1989; 461: 73-87.

2. G. J, Silveira, Raymond, A. G. Hughson,R. E. Race, V. L. Sim, S.F. Hayes,B. Caughey: Nature 437, 257-261 (2005).

3. S. Hupfeld, A. M. Holsater, M. Skar, C. B. Frantzen, M. Brandl: Journal of Nanoscience and Nanotechnology 6, 1-7 (2006).

4. C. Augsten, K. Mäder: International Journal of Pharmaceutics 351 (1-2), 23-30 (2008).

5. A. Citkowicz, H. Petry, R. N. Harkins, O. Ast, L. Cashion, C. Goldmann, P. Bringmann, K. Plummer, B. R. Larsen: Analytical Biochemistry 376, 163-172 (2008).

6. S. Podzimek: Journal of Applied Polymer Science, 54, 91-103 (1994).

7. P. J. Wyatt: Analytica Chimica Acta, 272, 1-40 (1993).

8. S. Podzimek, T. Vlcek and C. Johann: Journal of Applied Polymer Science, 81, 1588-1594 (2001).




Tłumaczenie na język polski: Jacek Achrem-Achremowicz