Wojciech Kamysz
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe, Lipopharm.pl
strony wersji drukowanej: 54-58




Niniejszy tekst jest adresowany przede wszystkim do osób chcących pracować na HPLC, ale z różnych powodów jeszcze tego nie zrobiły. Doświadczeni „chromatografiści” nie powinni tekstu czytać…

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) obecnie jest jedną z najważniejszych (o ile nie najważniejszą) technik analitycznych zarówno w laboratoriach naukowych jak i przemysłowych.

Substancje chemiczne występują zwykle jako substancje proste lub w postaci mieszaniny. Identyfikacja i ilościowe oznaczenie tych pierwszych jest proste i nie wymaga zwykle zaawansowanych narzędzi analitycznych. W przypadkach takich wystarcza zwykle prosty spektrofotometr, pehametr lub zestaw do miareczkowania.

Problem pojawia się, gdy trzeba zidentyfikować oraz oznaczyć ilościowo składniki mieszanin. Zawodzą wtedy proste metody a mieszaninę należy rozdzielić na poszczególne składniki. Można tego dokonać wykorzystując przemiany fazowe (np. odparowywanie, krystalizacja), proste działania fizyczne (np. filtracja, wirowanie). W dużej części przypadków takie jednak podejście nie wystarcza i rozdzielenie substancji trzeba wykonać z użyciem chromatografii. Chromatografia ma ponad 110 lat, ale pomimo tego dla niektórych jest zagadnieniem trudnym w teorii jak i praktyce. Dlaczego? Bo jej w praktyce nie zastosowali. Dlaczego jej nie zastosowali? Bo nie umieją obsłużyć sprzętu pomimo nierzadko olbrzymiej wiedzy teoretycznej na temat chromatografii. Nieumiejętność tej obsługi to wina jak zwykle braku czasu, ale i oprogramowania sterującego. Często zbyt zaawansowane i w wielu przypadkach, szczególnie zastosowaniach naukowych niepotrzebnie rozbudowane oprogramowanie powoduje, że obsługa HPLC jest dla wybrańców. Czy aby zobaczyć obrazek (tj. chromatogram) potrzebne jest około 30-50 ikon, z których nie wiadomo w co kliknąć aby spowodować przepływ eluentu?






Rys. 1. Przykłady oprogramowania chromatograficznego. Od góry: Galaxie, Clarity, i LP-chrom.


Bez wątpienia rozbudowane oprogramowania posiadają możliwość wykonania niemal każdej czynności podczas obróbki wyników. Są one szczególnie użyteczne w laboratoriach przemysłowych, gdzie chromatograf jest często jedynym lub jednym z nielicznych urządzeń w działach kontroli jakości. W laboratoriach badawczych i akademickich przerost możliwości w praktyce blokuje pracę na chromatografach HPLC. W ramach danych działów, na uczelniach Zakładów, tylko wybrane osoby umieją wykonać pomiar a wiedza praktyczna związana z HPLC jest bardzo niewielka.

Idea chromatografii HPLC
Chromatografia jest obecnie najważniejszą metodą analityczną w każdym laboratorium czy to naukowym, czy przemysłowym. Stanowi doskonałe narzędzie do separacji składników, ich identyfikacji dając jednocześnie możliwość szybkiego ich ilościowego oznaczenia. Właśnie, szybkiego oznaczenia. Poprawny chromatogram powinien być w miarę krótki a sygnały powinny być skutecznie rozseparowane i „ostre”.

Wiedza dotycząca chromatografii HPLC całkiem niepotrzebnie urosła do poziomu wiedzy tajemnej. Całkiem bezpodstawnie. Około 80-90% użytkowników na świecie stosuje rozdziały gradientowe w układzie woda-acetonitryl z detekcją UV-Vis. Zwykle dla związków biologicznie czynnych wystarczy detektor UV, gdyż mało kto stosuje długość fali wykraczającą poza 300 nm (zwykle, literaturowo jako zakres promieniowania UV podaje się 190-380 nm). Aby skutecznie oznaczyć substancje lub składnik mieszaniny wystarczy znaleźć w literaturze lub internecie orientacyjne dane (lub samemu zmierzyć na spektrofotometrze), gdzie substancja posiada maksimum absorpcji promieniowania. N astrzyknąć na chromatograf wykorzystując, np. gradient 2-80 % acetonitrylu. Stosując uproszczenie, jeśli substancja jest polarna pojawi się szybko na chromatogramie. Jeśli jest mniej polarna czas retencji będzie dłuższy. Chcąc lepiej rozseparować składniki mieszaniny wystarczy zwykle „spłaszczyć gradient”, np. stosując 2-30 % acetonitrylu dla związków o mniejszej retencji.

HPLC w dwa kwadranse
Dobry nauczyciel jest w stanie nauczyć podstaw obsługi HPLC w dwa kwadranse. Jeśli się to nie uda, to albo nauczyciel słaby albo uczeń mało pojętny. Postęp, który się dokonał w ostatnich latach w zakresie nowych złóż chromatograficznych pozwala na wykonanie poprawnych pomiarów w czasie 4-5 minut. Dotyczy też to urządzeń starego typu. „Sercem” bowiem każdego układu chromatograficznego jest kolumna chromatograficzna . Aby osiągnąć poprawne wyniki wystarczy sprzęt (chromatograf) nawet sprzed 10-20 lat.


Rys. 2. Przykład szybkiej analizy skomplikowanej mieszaniny peptydów. Chromatograf Beckman Gold wraz z oprogramowaniem LP-chrom. liniowy gradient 5-60% acetonitrylu w wodzie, kolumna Agilent Poroshell 120 SB-C18 2,7μm; 4,6x30 mm. Szybkość przepływu 4 ml/min. Detekcja 214nm. Całkowity czas analizy 3,5 minuty.


Bardzo bym chciał obsługiwać, ale tylko widziałem na zajęciach
System nauczania chromatografii HPLC w całej Polsce zwykle wygląda podobnie. Znajduje to odzwierciedlenie w listach motywacyjnych o pracę, gdzie wymóg umiejętności pracy na HPLC na pewnych stanowiskach jest często obligatoryjny. Absolwenci kierunków przyrodniczych słyszeli o tej technice (czasami widzieli), ale nie używali. Asystent na zajęciach coś pokazuje (oczywiścienajpierw 2 godziny opowiada zamiast od razu puścić pomiar i wtedy opowiadać) po czym coś dozuje by po 20-30 minutach otrzymać chromatogram. Zwykle ów nieszczęśnik, oderwany od swoich codziennych zajęć, robionego z czegoś innego doktoratu, sam niewiele wie co dokonał. Co pozostaje studentom z tej prezentacji? Mniej więcej tyle co umiał ów prowadzący. Niewiele.

A wystarczy kolumna, dwie pompy, dozownik i detektor
Typowy chromatograf cieczowy składa się z kolumny (to na niej zachodzi rozdzielenie składników), pomp chromatograficznych (one tłoczą eluent i próbkę przez wypełnienie kolumny), dozownika do nanoszenia próbki oraz detektora, który ma „zobaczyć” co z kolumny wychodzi i wykreślić to w postaci chromatogramu.

Kolumna w olbrzymiej większości przypadków wypełniona jest modyfikowaną łańcuchami alkilowymi C8 lub C18 krzemionką. To na tym złożu zachodzą procesy podziałowe co jest podstawą chromatografii w układzie faz odwróconych. Klasyczna kolumna posiada wymiary wewnętrzne 4,6x150 mm i jest wypełniona złożem o średnicy ziaren sorbentu 3,5 lub 5 μm.

W układzie faz odwróconych stosuje się dwa podstawowe rozpuszczalniki, wodę i acetonitryl (ACN).To je pompuje z osobna każda z pomp, zwykle w postaci liniowo zmieniającego się gradientu stężenia, np. 2-80 % ACN w 10 minut. Aby udało się wywołać przepływ przez kolumnę o tak drobnym złożu trzeba stosować pompy ociągające bardzo wysokie ciśnienia. Będące obecnie w sprzedaży głowice pompujące chromatografów osiągają ciśnienie do minimum 400 bar (systemy ultra wysokosprawne nawet ponad 1300 bar). Aby to zobrazować należy to ciśnienie porównać z ciśnieniem w kole samochodowym, które wynosi zaledwie 3 bar. Chromatografy są czasem wyposażone w jedną pompę a pompowanie dwóch eluentów jednocześnie odbywa się z pomocą zaworu proporcjonującego przełączającego pompę na ułamek sekundy na jeden lub drugi eluent.

Wypływający z kolumny eluat poddaje się analizie w detektorze, którego najważniejszymi elementamisą cela pomiarowa oraz lampa, która emituje promieniowanie absorbowane przed chromofory (ugrupowania zdolne do absorpcji promieniowania) analizowanych związków. Dotyczy to oczywiście detektorów UV-Vis. Pochłaniane przez próbkę promieniowanie jest na detektorze rejestrowane i po przetworzeniu na sygnały wykreślane w postaci chromatogramu. W innych typach detektorów sposób analizy jest odmienny.

Rysunek 3 pokazuje chromatografy o budowie modułowej. Coraz więcej firm sprzedaje urządzenia w postaci jednego ładnego „pudełka” co ze względu na ergonomię jest wielce pożądane, jednak ze strony serwisowej uniemożliwia wykonanie bez ingerencji serwisu wymienienia podstawowych nawet elementów. Często uniemożliwia też rozbudowę zestawu lub łączenie ze sobą elementów chromatografów różnych firm.


Rys. 3. Schemat typowego gradientowego chromatografu HPLC oraz widok rzeczywistych zestawów firm Knauer oraz Beckman.


5 minut przygotowań i urządzenie gotowe do analiz
Przygotowanie chromatografu HPLC do pracy jest proste i składa się z następujących czynności:

1. Włączenie chromatografu do zasilania.

2. Włączenie lampy w detektorze oraz wybranie długości fali.

3. Odpowietrzenie pomp.

4. Płukanie/mycie kolumny (przepuszczenie kilku mililitrów rozpuszczalnika B).

5. Równoważenie kolumny (kondycjonowanie) kolumny wybrana fazą ruchomą.

6. Wykonanie wstępnego pomiaru bez próbki (tzw. blanka).

Jeśli nie liczyć punktu 5 całość czynności nie powinny zająć wprawnemu chromatografiście więcej niż 3-5 minut. Procesy te można oczywiście zautomatyzować i rozbudowane systemy chromatograficzne wykonują je automatycznie.

Należy się też tutaj wyjaśnienie, że chromatografy mogą zawierać inne detektory niż UV-Vis (np. fluorescencyjne, konduktometryczne, refraktometryczne, masowe) i w takich przypadkach przygotowanie do pracy przebiega w inny sposób.

Wspólne jest jednak zawsze przygotowanie pomp poprzez ich odpowietrzenie, czyli przepuszczenie przez głowice pomp dużego przepływu eluentu celem pozbycia się ewentualnych pęcherzy powietrza.

Może coś zmierzę, ale co?
Z obsługą HPLC jest podobnie jak z jazdą samochodem. Trzeba chociaż ruszyć aby mieć pojęcie na czym polega prowadzenie auta. W przypadku HPLC trzeba wykonać pomiar/pomiary. Słuchanie wielogodzinnych wykładów i specjalistycznych szkoleń nie da tego co kilka szybkich pomiarów.


Rys. 4. Przykład analizy napojów zawierających kofeinę. Liniowy gradient 2-80 % acetonitrylu w wodzie. Kolumna Phenomenex Luna C8, 5μm; 4,6x150 mm. Szybkość przepływu 2 ml/min. Detekcja 254 nm. A) Pepsi, deklarowna na puszce zawartość kofeiny 0,1 mg/ml, B) kawa rozpuszczalna autora, zawartość kofeiny obliczona na podstawie zawartości kofeiny w napoju pierwszym 2,74 mg/ml.


Co więc ważne by zacząć?
Dobry nauczyciel, który w dwa kwadranse pokaże jak HPLC działa i pozwoli wykonać samodzielnie pomiar. Dobra (nie zużyta) kolumna i zdrowy rozsądek pozwolą na wiarygodne wyniki już po pierwszych analizach. Pomiar ma być szybki, piki rozdzielone i ostre. I zwykle tylko o to chodzi…