Michelle Chen
Wyatt Technology Corporation
strony wersji drukowanej: 22-25



Agregacja białek może następować na każdym etapie rozwoju formulacji białkowych. Do badania tego procesu opracowano szereg metod opartych na rozpraszaniu światła laserowego, umożliwiających wyznaczanie składu agregatów białkowych w formulacjach terapeutycznych, poprzez zastosowanie ortogonalnych metod.

Agregacja białek jest zjawiskiem zachodzącym w trakcie wytwarzania, przechowywania, transportu oraz podawania pacjentowi produktu zawierającego białko terapeutyczne. Ponieważ agregaty białkowe mogą znacząco wpłynąć na stabilność, skuteczność i bezpieczeństwo terapeutyku, ich rozmiary oraz liczność muszą być określone na każdym etapie procesu produkcyjnego.

Na ogół wielkości agregatów białkowych wahają się od kilku nanometrów do setek mikrometrów. Jakkolwiek ilość ledwie widocznych i większych, dobrze widocznych agregatów jest ważną cechą końcowego białkowego produktu terapeutycznego, mniejsze rozpuszczalne i nierozpuszczalne agregaty także odgrywają rolę w krótko- i długoterminowej stabilności [1]. Oczyszczanie białekAgregaty takie obserwuje się przez cały czas w trakcie badania białek, procesach oczyszczania i formulacji, a ich wykrywanie oraz charakterystyka (zwłaszcza we wczesnych etapach) są krytyczne dla zrozumienia mechanizmu(ów) prowadzących do niestabilności, a zatem określają warunki minimalizujące liczbę agregatów w dostarczanych terapeutykach.

Techniki statycznego i dynamicznego rozpraszania światła
Techniki rozpraszania światła (LS, Light Scattering) zarówno statycznego (SLS, Static Light Scattering) i dynamicznego (DLS, Dynamic Light Scattering), od dawna są stosowane do charakteryzowania agregatów białkowych o średnicach od kilku nanometrów (monomer/oligomer niskiego rzędu) do mikrometrów (agregaty wyższego rzędu i cząstki agregatów) [2]. Ze swojej istoty, intensywność sygnału rozpraszanego światła jest proporcjonalna do jednocześnie masy cząsteczkowej i stężenia związku(ów) w roztworze (lub w stabilnej zawiesinie). Dzięki temu, detektory rozpraszania światła są bardzo czułe w wykrywaniu dużych agregatów, które występują nawet w małych ilościach. Co więcej, nowoczesne detektory SLS i DLS, mogą być sprzężone z technikami frakcjonowania przepływowego, jak chromatografia żelowa (SEC, Size Exclusion Chromatography) i frakcjonowanie przepływowe w polu sił (FFF, Field Flow Fractionation), co umożliwia uzyskanie doskonałej rozdzielczości i pełnej charakterystyki (stan oligomeryczny, wielkości cząstek i koncentracja) różnych subpopoulacji cząstek obecnych w formulacjach białkowych. Chociaż obydwie metody rozdzielają cząstki w oparciu o objętość hydrodynamiczną, SEC jest zwykle wykorzystywana do rozdziału białek, podczas gdy FFF może być stosowana zarówno do białek jak i nanocząstek.
SEC jest dość powszechna w większości laboratoriów i była powszechniej stosowana niż FFF do rozdzielania i oznaczania ilościowego stabilnych izoform białek od fragmentów i agregatów.

Jednakże w wielu przypadkach, takie produkty degradacji mogą być zmienione przed detekcją, zarówno wskutek oddziaływań niespecyficznych ze złożem kolumny SEC lub odfiltrowania (np. duże agregaty); z tego też powodu wymagane jest stosowanie ortogonalnych technik frakcjonowania [3]. Frakcjonowanie w polu sił (FFF) jest zaakceptowaną przez FDA (Food & Drug Administration) alternatywą dla SEC do rozdzielania i ilościowego oznaczania fragmentów białkowych oraz agregatów od monomeru lub stabilnego oligomeru. W FFF rozdział zachodzi w specjalnym kanale dzięki zróżnicowanej dyfuzji w przepływie laminarnym, co znacząco zmniejsza oddziaływania
powierzchniowe i filtrację. Dodatkowo, FFF posiada dobrą rozdzielczość dla cząsteczek o rozmiarach od małych białek do nanocząstek w szerokim zakresie mas cząsteczkowych/wielkości i zakresów stężeń, bez konieczności stosowania wielu kolumn chromatograficznych [4].

Tradycyjnie, SEC i FFF pozwalają oszacować masę cząsteczkową (Mw) w oparciu o objętość elucji wymywanego składnika w odniesieniu do zewnętrznych standardów (SEC) lub obliczeń opartch na teoretycznej wartości współczynnika dyfuzji (FFF). Masy cząsteczkowe uzyskane z tych semi-empirycznych podejść są często błędne, zwłaszcza gdy badana próbka ma inną konformację niż zastosowany standard lub model. Gdy wymagana jest znajomość dokładnej masy cząsteczkowej lub wyznaczenie heterogenności szczytu chromatograficznego (piku) konieczne staje się dołączenie do systemu frakcjonującego detektora statycznego rozpraszania światła (Rys. 1).


Rysunek 1: Chromatogram SEC-MALS białka BSA; pokazana masa cząsteczkowa względem czasu elucj i sygnał detektora UV.


rozpraszanie: nisko-kątowe (LALS, Low Angle Light Scattering), pod kątem prostym (RALS, Right Angle Light Scattering) oraz wielo-kątowe (MALS, Multi Angle Light Scattering), i MALS jest dotychczas zdecydowanie najbardziej dokładną, wszechstronną i powszechnie stosowaną detekcją do charakterystyki polimerów i biopolimerów [5]. Detektory MALS można stosować w trybie jednorazowym (ang. batch, wsadowym) lub w połączeniu z rozdziałem SEC lub FFF. Co istotne, dodanie detektora MALS do systemu SEC lub FFF pozwala nie tylko na pomiar absolutnej masy cząsteczkowej (tj. jest niezależnie od geometrii, gęstości i innych właściwości fizycznych), ale również daje dodatkowe informacje o stechiometrii koniugatów białkowych, średnich kwadratowych promieni (Rg, gdy większe niż 10 nm), danych dotyczących koncentracji cząstek agregatów, i innych parametrów.

Wyznaczanie struktury cząsteczkowej agregatu
Do zmierzenia promieni białek mniejszych niż 10 nm lub do określenia struktury cząstek agregatów równolegle obok MALS można zastosować DLS, po rozdzieleniu SEC lub FFF, co pozwala na wyznaczenie promieni hydrodynamicznych (Rh) wymywanych cząstek. W przypadku białek, połączone informacje z MALS (Mw) i DLS (Rh) mogą dostarczyć pewnego wglądu na poziomie molekularnym w konformację i stan pofałdowania. Dla większych cząstek, stosunek średniej kwadratowej promienia (Rg in. RMS) i promienia hydrodynamicznego (Rh) – odpowiednio z MALS i DLS – może być użyty nie tylko do określenia kształtu cząsteczki ale również określeniu rozkładu masy w jej obrębie (np. aby rozróżnić puste od wypełnionych klatek nanocząsteczkowych).

Warto zaznaczyć, że zarówno SEC jak i FFF rozcieńczają znacząco próbki w trakcie przebiegu rozdziału. Może to mieć nieprzewidziany wpływ na analizę, np. przesuwając w roztworze równowagę odwracalnie połączonych białek [6]. Aby dokładnie wyznaczyć dystrybucję agregatów białkowych, stosuje się często pomiary MALS lub DLS w trybie wsadowym. Analiza wsadowa jest w gruncie rzeczy podstawowym trybem stosowania techniki DLS i może być używana do śledzenia agregacji jako funkcji różnych czyników, jak np.: stężenie, skład buforu, temperatura i czas.

W przeciwieństwie do MALS, w DLS nie jest wymagana a priori znajomość stężenia. Czynniki te wzięte razem z możliwością przeprowadzenia pomiaru w czasie krótszym niż minuta uwypuklają DLS jako wygodne narzędzie do wysokoprzepustowego badania stabilności formulacji, zwłaszcza z użyciem zautomatyzowanego DLS z płytkami wielodołkowymi. Jakkolwiek technika DLS w trybie wsadowym jest nieprawdopodobnie czuła na obecność śladowych ilości agregatów, to aby zaobserwować ich oddzielne subpopulacje, konieczne jest aby promienie agregatów różniły się między sobą co najmniej czterokrotnie. Ewolucja oligomerów niższego rzędu może być monitorowana tylko za pomocą pośredniej miary (np. indeksu polidyspersyjności) jako przybliżenia. Nie jest to oczywiście ograniczeniem dla pomiarów DLS po rozdziale w trybie chromatograficznym (Rys. 2A).


Rysunek 2A; Chromatogram kompleksu białko-nukleosom z detekcją DLS; pokazana wielkość promienia hydrodynamicznego (Rh) względem czasu elucj i sygnał detektora UV.


Podobnie jak w DLS, pomiary wsadowe MALS wyznaczają Mw związków obecnych w próbce z ograniczoną rozdzielczością [7]. W porównaniu tym jednak MALS jest znacznie bardziej czuła niż DLS przy oznaczaniu zmienności pomiędzy seriami. W optymalnych warunkach technika wsadowego MALS może z łatwoscią wykryć 1% zmianę w średniej Mw powstałą z niewielkiej różnicy zarówno typu jak i ilości agregatów w roztworze. Przy pomiarach dla różnych stężeń, wsadowy MALS pozwala na scharakteryzowanie odwracalnej samo-asocjacji białek oraz określenie ilościowo i jakościowo różnych stanów oligomerycznych występujących w próbce w szerokim zakresie stężeń [9].

Zakończenie
Podsumowując, do charakteryzowania właściwości fizykochemicznych oraz w rozwoju formulacji biofarmaceutycznych stosowane są najczęściej dwa podstawowe typy detekcji rozproszonego światła: statyczna i dynamiczna. Obydwa typy mogą być stosowane w trybie analizy wsadowej albo do rozszerzonej detekcji/charakterystyki w sprzężeniu z różnymi technikami frakcjonowania. Zastosowanie detekcji rozpraszania światła po frakcjonowaniu (za pomocą SEC lub FFF) pozwala na rozdział i charakterystykę różnych agregatów w roztworze białkowym, które są związane nieodwracalnie, jakkolwiek sam proces rozdzielania może czasami zmienić stan agregacji i/lub ilość agregatów w próbce. Zaburzenia takie nie występują w trakcie pomiarów jednorazowych.

Przeciwnie, pomimo że rozdzielczość dla różnych populacji jest ograniczona, analiza wsadowa jest świetnym narzędziem do wysokoprzepustowego przesiewowego badania warunków w roztworze sprzyjających agregacji, jak również do charakteryzowania różnych specyficznych i niespecyficznych asocjacji. Każde z tych ortogonalnych i wzajemnie uzupełniających podejść niezależnie dostarcza użytecznych informacji, a gdy są stosowane jednocześnie tworzą razem potężny zestaw narzędzi do wszechstronnej charakterystyki zjawiska agregacji w roztworach białkowych (rys. 2A i rys. 2B – badany kompleks białkowy ma przy różnych rozmiarach tą samą masę cząsteczkową !).


Rysunek 2B; Chromatogram kompleksu białko-nukleosom z detekcją MALS; pokazana masa cząsteczkowa względem czasu elucj i sygnał detektora UV. Różniące się wielkością formy białka mają taką samą masę cząsteczkową – prawdopodobnie różne konformacje.


PIŚMIENNICTWO

1. J. F. Carpenter, T. W. Randolph, W. Jiskoot, D. J. Crommelin, C. R. Middaugh, G. Winter, Y. X. Fan, S. Kirshner, D. Verthelyi, S. Kozlowski, K. A. Clouse, P. G. Swann, A. Rosenberg, B. Cherney, “Overlooking subvisible particles in therapeutic protein products: gaps that may compromise product quality”, J. Pharm. Sci., 98(4), 1201-1205, (2009).

2. T. Liu, B. Chu, Light-Scattering by Proteins, Encyclopedia of Surface and Colloid Science, Marcel Dekker, 3023-3043, (2002).

3. A. Rosenberg, Effects of protein aggregates: an immunologic perspective, The AAPS Journal, 8(3), E501-E507, (2006).

4. S. Podzimek, Asymeetric flow field flow fractionation, Encyclopedia of Analytical Chemistry, Online, John Wiley & Sons, 1-19 (2012).

5. P.J. Wyatt, “Light Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules”, Anal. Chim. Acta, 272, 1-40 (1993).

6. B. Demeule, C. Palais, G. Machaidze, R. Gurny, T. Arvinte, “New methods allowing the detection of protein aggregates: A case study of trastuzumab”, mAbs, 1(2), 142-150, (2009).

7. D. Some, S. Kenrick, “Characterization of protein-protein interactions via static and dynamic light scattering”, Book: Protein Interactions, Ch 20, 401-426, (2012).

8. M. Marlow, “Rapid, autonomous lot-to-lot comparability of monoclonal antibodies with the Calypso”, www.wyatt.com, CG-MALS Application Note, 10, (2012).

9. R. Esfandiary, D. B. Hayes, A. Parupudi, J. Casas-Finet, S. Bai, H. S. Samra, A. U. Shah, H. A. Sathish, “A Systematic Multitechnique Approach for Detection and Characterization of Reversible Self-Association during Formulation Development of Therapeutic Antibodies”, J. Pharm. Sci., 102(1), 62-72, (2013)