Tomasz Wasilewski
Gdański Uniwersytet Medyczny



Alexander Graham Bell zwykł mawiać, że najtrudniej zmierzyć zapach: „Czy kiedykolwiek mierzyłeś zapach? Czy możesz powiedzieć, że jeden zapach jest silniejszy od drugiego? Czy możesz zmierzyć różnicę między rodzajami zapachów? Jest oczywiste, że w świecie występuje wiele rodzajów zapachów, od zapachu fiołków i róż po asafetydę (red. przyprawa z Iranu i Afganistanu). Dopóki nie zmierzysz ich podobieństw i różnic, nie masz żadnej wiedzy na temat zapachu. Jeśli jesteś ambitny, zmierz zapach”. Współczesne narzędzia służące do monitoringu i identyfikacji substancji zapachowych w pewnym stopniu pozwalają sprostać przedstawionym problemom. Nowoczesna analiza zapachów związana jest z różnymi technikami i urządzeniami, wśród których wyróżnić można elektroniczny nos (ang. artificial nose, odor-sensing system, electronic nose, e-nose).

Wraz z rozwojem wiedzy na temat mechanizmów warunkujących powonienie w biologicznych układach węchowych zaobserwować można znaczący postęp w dziedzinie czujników zapachu. Badania dotyczące percepcji zapachu, na poziomie genówi białek, opublikowane w 2004 roku przez noblistów Richarda Axela i Lindę Buck, znacząco wyjaśniły procesy odczytywania przez mózg informacji zapachowych. Krokiem milowym było odkrycie genów kodujących białka receptorowe, z rodziny rodopsynopodobnych, które reagują na określoną substancję chemiczną. Ludzki nos należy do naturalnych czujników oceny jakości powietrza. Informacje o charakterystyce zapachu, mogą być odbierane przez człowieka świadomie oraz podświadomie. Nieprzyjemne zapachy są w sposób naturalny kojarzone z zagrożeniem, stwarzają poczucie dyskomfortu i mogą być przyczyną negatywnych objawów psychosomatycznych.

Klasyczne metody analizy substancji gazowych opierają się głównie na wykorzystywaniu chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas (GC-MS). Techniki olfaktometryczne, panele sensoryczne, wykorzystywane są do oceny uciążliwości odorowej i stanu powietrza. Do wykrywania i monitoringu substancji zapachowych, niebezpiecznych i/lub wybuchowych powszechnie stosowana jest spektrometria ruchliwości jonów (IMS), techniki chemiluminescencyjne (CL), detekcja UV, spektroskopia Ramana lub trenowane psy. Mimo niekwestionowanych zalet dotychczas stosowanych technik, poszukiwane są nowe rozwiązania konstrukcyjne i aparaturowe, które mogłyby przezwyciężyć niektóre niedogodności, związane ze stosowaniem klasycznych metod analizy zapachów.

Do urządzeń, które w najbliższej przyszłości mogą stać się ich uzupełnieniem, należą czujniki chemiczne lub urządzenia złożone z matrycy czujników. Urządzeniem, które w uproszczony sposób naśladuje ludzki zmysł węchu jest elektroniczny nos.

Dynamiczny rozwój tego typu urządzeń potwierdza analiza danych literaturowych z ostatnich kilku lat (Rysunek 1).


Rysunek 1. Liczba publikacji naukowych dotycząca elektronicznych nosów, na przestrzeni ostatnich lat (wg bazy PubMed).


Pierwsze próby identyfikacji zapachów z użyciem matrycy czujników datuje się na lata 60-te, przedmiotem wynalazku był tzw. nos mechaniczny. Nos elektroniczny po raz pierwszy został zaprezentowany przez Wilkensa i Hatmana. Jednak koncepcja urządzenia złożonego z inteligentnej matrycy czujników, umożliwiającego klasyfikację odorów, rozpropagowana została dopiero 20 lat później w publikacjach Parsauda, Dodda i Ikegami’ego. Podczas pierwszej konferencji naukowej poświęconej zagadnieniu nosa elektronicznego zapoczątkowano położenie większego nacisku na rozwój urządzeń, mających w zamyśle przezwyciężyć ograniczenia technik olfaktometrycznych służących ocenie stężenia i różnorodności gazów. Göpel po raz pierwszy zaproponował wykorzystanie neuronów zapachowych jako elementów czułych, zasugerował, że biomolekuły obecne na powierzchni czujników mogą być wykorzystywane do opracowywania czujników o wysokiej czułości (o granicach wykrywalności na poziomie takim jak u psów, do wykrywania narkotyków, materiałów wybuchowych itp.).

Etapy rozwoju sztucznych zmysłów, zarówno chemicznych jak i biologicznych, przedstawiono w Tabeli 1.


Tabela 1. Kamienie milowe w rozwoju urządzeń z grupy elektronicznych nosów.



Sztuczne nosy są obecnie uzupełnieniem dla stosowanych metod analizy sensorycznej, jednak niedoskonałość klasycznych technik, objawiająca się m.in. subiektywnością paneli sensorycznych, analizą substancji na wysokich poziomach stężeń, skłania ku wprowadzaniu lub zastępowaniu ich przez urządzenia bardziej wyspecjalizowane. Utrudnienia związane z używaniem klasycznych metod analizy zapachów mogą być wyeliminowane poprzez zastosowanie urządzeń pozwalających na szybką i niewymagającą wysokich kosztów analizę zapachów. Liczne doniesienia literaturowe odnoszące się do teoretycznych podstaw działania e-nosów i praktycznych możliwości ich zastosowania są podstawą do twierdzenia, że rozwój analityki zapachów jest związany z wykorzystaniem elektronicznych nosów. Próby udoskonalenia elektronicznych nosów, m.in. pod względem czułości i selektywności skutkują powstawaniem prototypów bioelektronicznych nosów. Wciąż rozwijane są możliwości aplikacyjne tego typu urządzeń, wprowadzane są na rynek nowe urządzenia o uproszczonej zasadzie działania i obsłudze. Co równie istotne, są coraz bardziej atrakcyjne cenowo.

Zasada działania
Możliwość odczuwania przez człowieka tysięcy różnych zapachów determinowana jest przez złożoną budowę nabłonków węchowych wyściełających jamę nosową, gdzie umiejscowione jest kilka milionów neuronów węchowych. Na zakończeniach ich zmodyfikowanych dendrytów występują włosowate wypustki wykrywające substancje zapachowe. Bodźce zapachowe odbierane zostają poprzez rzęski umieszczone w nabłonku węchowym. Według najnowszych wyników badań mechanizmów percepcji zapachów na poziomie genów i białek wykazano, że ze względu na segregację przestrzenną neuronów i aksonów, każdy odorant pobudza określony zestaw kłębuszków węchowych. Ludzkie geny kodujące określone białka receptorowe odpowiedzialne są za przechwytywanie substancji zapachowych. Natomiast węchomózgowie uznawane jest za ośrodek odpowiedzialny za rozróżnianie zapachów. Różnice w budowie białek receptorowych determinują oddziaływania z różnorodnymi odorantami. Sygnał po dotarciu do węchomózgowia jest tak przetworzony, by był rozpoznawany jako zapach. Bodźce z tych samych receptorów zapachowych docierając do różnych węchowych obszarów korowych umożliwiają równoległe i zróżnicowane przetwarzanie tych samych bodźców zmysłowych. Neurony korowe integrują informację zapachową, co umożliwia odczuwanie zapachu.

Zasada działania nosa elektronicznego w dużej mierze powiązana jest z systemem powonienia znanym z ludzkiego odpowiednika. Mechanizmy identyfikacji substancji zapachowych zaimplementowane w elektronicznych analogach są bardzo podobne do tych występujących w ludzkim nosie. Sercem w budowie sztucznych nosów jest matryca czujników. Pobudzanie jej elementów czułych w określonych typach systemów wykrywania i identyfikacji zapachów prowadzi do generowania specyficznych sygnałów. Jednak dopiero odpowiednia metoda przetwarzania otrzymanych sygnałów i analizy danych umożliwia wygenerowanie unikalnych odpowiedzi (odcisków palca - odour fingerprints) dla poszczególnych próbek zapachowych. Rozpoznanie danej próbki gazowej możliwe jest nie dzięki pobudzeniu całej matrycy czujników składających się na budowę elektronicznego nosa, lecz każdego z nich w różnym stopniu. W wyniku takiego pobudzenia powstaje charakterystyczny zbiór odpowiedzi z pojedynczych czujników. Analiza uzyskanego wektora odpowiedzi pozwala zakwalifikować daną próbkę gazową do zbioru wektorów odpowiedzi poznanych wcześniej. U człowieka rolę tę pełni mózg, który porównuje otrzymane z opuszki węchowej impulsy nerwowe do zawartej w pamięci bazy zapachów poznanych w ciągu życia. Wyróżniającą cechą urządzeń z grupy elektronicznych nosów spośród innej aparatury jest m.in możliwość zastosowania chemometrycznej analizy danych i krótki czas analizy. Otrzymany wektor odpowiedzi przypisywany jest do zbiorów znajdujących się w bazie danych komputera za pomocą odpowiednich metod przetwarzania danych, algorytmów statystyczno-chemometrycznych.

Na Rysunku 2 przedstawiono porównanie zasady działania elektronicznego nosa i biologicznego odpowiednika.


Rysunek 2. Schematyczne porównanie zasady działania elektronicznego i ludzkiego nosa.


Ze względu na budowę i zasadę działania czujniki stosowane do budowy matrycy nosów elektronicznych można podzielić kilka klas:

  • Elektrochemiczne (zmiana potencjału bądź oporności spowodowana przez przeniesienie ładunku),
  • Termiczne (zamiana temperatury, spowodowana oddziaływaniem chemicznym),
  • Masowe (zmiana masy spowodowana absorpcją substancji),
  • Optyczne (zmiany intensywności światła).

Czujniki chemiczne najczęściej pracują na zasadzie:

a)   Zmiany oporności:

  • Czujnik metal-tlenek-półprzewodnik (MOS – metal oxide semiconductor),
  • Przewodnościowy czujnik polimerowy (CP – conducting polimer),
  • Zespolony czujnik polimerowy (polimer composite).

b) Zmiany potencjału:

  • Tranzystor polowy MOS (MOSFET – metal oxide semiconductor field effect transistor),

c) Zmiany częstotliwości:

  • Objętościowa fala akustyczna (BAW - bulk acustic wave),
  • Akustyczna fala powierzchniowa (SAW -  surface acustic wave),

d) Bioczujniki, elementem aktywnym jest biomateriał naniesiony na odpowiedni przetwornik.

e) Innej, np. spektrometr mas.

Rodzaj i właściwości czujników zastosowanych w matrycy określają jej możliwości analityczne. Różnice w czułości i selektywności poszczególnych elementów matrycy poprawiają różnorodność informacji zawartych w danych pomiarowych. Ważnym czynnikiem przy wyborze komercyjnego, czujnikowego systemu pomiaru jest jego cena oraz dostępność. Czujniki stosowane w matrycy elektronicznego nosa powinny w idealnym przypadku spełniać następujące kryteria:

  • Wysoka czułość w stosunku do związków chemicznych, porównywalna do czułości ludzkiego nosa,
  • Duża odporność na warunki zmienne warunki atmosferyczne, głównie temperaturę i wilgotność,
  • „Średnia selektywność” w stosunku do “obcych” substancji występujących w mieszaninie gazowej, która czasami jest korzystniejsza od wysokiej,
  • Wysoka stabilność, powtarzalność i odtwarzalność,
  • Krótki czas odpowiedzi i regeneracji,
  • Łatwa kalibracja i uproszczony system przetwarzania danych,
  • Niewielki rozmiar i niska cena.

Informacja o składzie mieszaniny gazowej możliwa jest do uzyskania dzięki wykorzystaniu matrycy czujników i odpowiedniej metody przetwarzania i analizy danych. Jedną z najprostszych metod analizy danych, uzyskanych dzięki użyciu zestawu czujników pomiarowych jest metoda, która polega na przedstawieniu danych w formie histogramu lub diagramu kołowego. Do interpretacji wyników uzyskanych z wykorzystaniem elektronicznego nosa stosuje się metody chemometryczne oparte na zastosowaniu:

  • Analizy głównych składowych (PCA – Principal Component Analysis),
  • analizy dyskryminacyjnej (DA – Disciminant Analysis),  
  • dyskryminacyjnej analizy fluktuacyjnej (DFA - Discriminant Function Analysis),
  • maszyny wektorów nośnych (SVM – Support Vector Machine),
  • metody częściowych najmniejszych kwadratów (PLS – Partial Least Squares),
  • jądrowej metody analizy głównych składowych (KPCA – Kernel Principal Component Analysis),
  • jedno- i wieloczynnikowej analizy wariancji (ANOVA – Analysis of Variance).
  • Odpowiedź czujników może być również skorelowana z danymi uzyskanymi w wyniki przeprowadzenia analizy olfaktometrycznej, gdzie najczęściej wykorzystuje się sztuczne sieci neuronowe (ANN – Artificial Neural Network).

Zastosowania elektronicznych nosów w analizie zapachów
Czynnikami determinującymi możliwości pomiarowe matrycy są ilość i rodzaj wykorzystywanych czujników. Czasami duża liczba tych elementów może poprawić zdolność pomiarową układu. Z drugiej strony, duży zbiór czujników skutkuje większym nakładem obliczeniowym i czasem potrzebnym do przetworzenia uzyskanych danych. Ponadto, w układach wielokomponentowych mogą występować czujniki nadmiarowe, niegenerujące istotnych sygnałów. Poprzez odpowiednią selekcję dąży się do zmniejszania liczby czujników w matrycy. Przy takim podejściu można opracować instrumenty specyficzne dla konkretnej aplikacji, np. analizy pewnych rodzajów żywności, diagnostyki medycznej, określonych procesów technologicznych. Zakres
stosowania takich urządzeń jest oczywiście ograniczony.

W ostatnich latach zaobserwować można wzrost zainteresowania zastosowaniami elektronicznego nosa głównie w:

  • medycynie (np. wykrywanie biomarkerów chorób),
  • przemyśle perfumeryjnym (np. ocena autentyczności),
  • przemyśle spożywczym (np. ocena jakości produktów żywnościowych),
  • monitoringu środowiska (np. ocena uciążliwości zapachowej, skuteczności oczyszczania ścieków),
  • przemyśle wojskowym (np. identyfikacja gazów bojowych),
  • wykrywanie substancji niebezpiecznych (np. na lotniskach),
  • i wielu innych.

Dynamiczny rozwój urządzeń z grupy elektronicznych nosów wpływa na powszechniejszą komercjalizację tych urządzeń. Jako ciekawostkę można nadmienić, że jeden z pierwszych komercyjnych zestawów czujników miał dość niekonwencjonalne zastosowanie. Jednym z przysmaków kuchni francuskiej są trufle, które odnajdywane są m.in. przez specjalne szkolone świnie lub psy. Opracowany przenośny system wykrywania substancji zapachowych nadających tym grzybom charakterystyczny zapach, umożliwił zastępowanie zwierząt w ich wykrywaniu. W obecnych czasach spektrum aplikacyjne elektronicznych nosów jest znacznie szersze. Oprócz urządzeń koncepcyjnych w handlu dostępnych jest wiele kompletnych elektronicznych nosów, sprzężonych z komputerem, wyposażonym w odpowiednie oprogramowanie. Do firm, które zdominowały rynek elektronicznych nosów, należą: Alpha MOS (Francja), Airsense, Odotech (Kanada), Sensigent (USA), Electronic Sensor Technology (USA), Scensive Technology (Wielka Brytania), The Enose Company (Holandia). Dynamiczny rozwój z zakresu czujników skutkuje miniaturyzacją i zwiększeniem ich mobilności. Przykłady urządzeń dostępnych komercyjnie i będących na etapie wprowadzania na rynek przedstawiono na Rysunku 3.


Rysunek 3. Przykłady urządzeń dostępnych w handlu.


Perspektywy rozwoju urządzeń z grupy elektronicznych nosów - bioelektroniczne nosy
Na przestrzeni ostatnich kilkudziesięciu lat podejmowano wiele prób unormowania metod analizy odorantów występujących w różnego rodzaju matrycach. Klasyczne metody analizy zapachów, takie jak GC/MS, panele sensoryczne, wytrenowane zwierzęta są wciąż powszechnie stosowane. Jednak niektóre z występujących niedogodności, wynikające m.in. ze stopnia skomplikowania, wyspecjalizowanego personelu, czasu analizy, ceny itp., skłaniają ku opracowywaniu nowych urządzeń i technik analizy zapachów. W ostatnim czasie, jako metody uzupełniające wymienione techniki, coraz częściej stosowane są urządzenia z grupy elektronicznych nosów. Intensywny rozwój urządzeń z grupy elektronicznych nosów ukierunkowany jest na opracowywanie:

  • czujników o wysokiej czułości, specyficzności i szybszym czasie odpowiedzi,
  • miniaturyzacji, zwiększenie mobilności i obniżenie kosztów,
  • systemów czujników, które generują sygnały podobne do tych występujących w biologicznych odpowiednikach,
  • układów elektronicznych, które odwzorowywałyby ludzki nos lub mózg.

Analiza z wykorzystaniem elektronicznych nosów najczęściej nie daje odpowiedzi odnośnie stężenia poszczególnych związków w mieszaninie, lecz charakteryzuje próbkę, jako holistyczny obraz występujących zapachów. Niektóre ograniczenia wynikają z braku możliwości naśladowania przez elektroniczny nos węchu biologicznego, co związane jest z brakiem zdolnych do tego biomolekuł. Szybkość działania, nieinwazyjna analiza próbki i prostota pomiaru sprawiają, że elektroniczne nosy stają się realną alternatywą dla innych popularnych metod analizy zapachów. Osiągnięcia z dziedziny czujników i bioczujników z zakresu elektroniki, biologii, inżynierii genetycznej, biotechnologii i nanotechnologii dają możliwość konstruowania i wdrażania urządzeń z zaimplementowanymi materiałami bioczułymi – bioelektronicznych nosów (BEN, bioelectronic nose, biomimetic electronic nose, bio- enose, b- enose). Możliwość dokładniejszego odwzorowania ludzkiego zmysłu węchu poprzez implementację wysoce selektywnych i czułych bioczujników stosowanych w bioelektronicznych nosach, może znacznie poszerzyć spektrum zastosowań urządzeń z grupy elektronicznych zmysłów. Działanie nosa bioelektronicznego jest ściśle powiązane ze schematem funkcjonowania jego biologicznego odpowiednika. Niektóre elementy ludzkiego nosa mogą być zaimplementowane w prototypach tego typu urządzeń.

Podstawowym założeniem w budowie bioelektronicznych nosów jest użycie białek receptorów węchowych jako elementu aktywnego czujnika. Elementy czułe matrycy mogą być zbudowane z białek receptorowych nabłonka węchowego (olfactory receptors - ORs), komórek wykazujących ekspresję białek receptorów zapachu lub peptydów odwzorowujących miejsca aktywne receptorów. Elementy bioczułe immobilizowane są bezpośrednio na przetworniku służącym do konwersji sygnału biologicznego na sygnał użyteczny analitycznie- elektryczny lub optyczny. Bioczujniki wykorzystywane w budowie tego typu bioenosów zbudowane są z dwóch elementów- przetwornika pierwotnego (elementu biologicznego) i wtórnego (elementu niebiologicznego).

Pod względem budowy bioczujników wyróżnia się bioelektroniczne nosy zbudowane z elementu czułego o różnym typie pokrycia (Rysunek 4).


Rysunek 4. Schematyczne przedstawienie budowy czujników nosa bioelektronicznego. Podstawowe trzy typy bio e-nosów różnią się elementami, które są osadzane na odpowiednim podłożu: a) komórki, b)białka receptorów zapachowych, c) syntetyczne peptydy.


Najczęściej detekcja opiera się na pomiarze sygnałów biologicznych z wykorzystaniem:

  • mikroelektrod,
  • spektroskopii impedancyjnej (EIS – electrochemical impedance spectroscopy),
  • mikrowag kwarcowych (QCM – quartz crystalmicrobalance),
  • tranzystorów polowych (FET – field effect transistor),
  • czujników powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR – surface plasmon resonance),
  • polimerów przewodzących (np. polipirol),
  • nanorurek węglowych,
  • grafenu i innych.

Jedną z najnowszych koncepcji wykorzystywania materiałów bioczułych do budowy ultraczułego i selektywnego bioenosa jest wykorzystanie do budowy nanopęcherzyków. Nanopęcherzyki, posiadające wszystkie elementy aktywne receptorów zapachowychw wyniku kontaktu z odorantami mogą generować sygnały podobne do tych wytwarzanych przez komórki. Podczas izolacji nanopęcherzyków z komórek zawarte są w nich wszystkie białka membranowe i składniki cytoplazmatyczne potrzebne do transdukcji sygnału. Dzięki temu, nanopęcherzyki charakteryzują się podobnymi właściwościami co komórki.

Dodatkowo, wykazują niektóre właściwości materiałów białkowych, takich jak możliwość produkcji na dużą skalę i łatwość w przechowywaniu. Dzięki niewielkim rozmiarom, sprzęgane są z nanomateriałami w celu ich funkcjonalizacji. Tego typu urządzenia mogą być stosowane między innymi w kontroli jakości produktów żywnościowych i diagnostyce chorób. Bioelektroniczny nos, którego budowa oparta jest na nanopęcherzykach, po raz pierwszy opracowany został w 2012 roku przez zespół T.H. Parka, umożliwiając selektywną identyfikację heksanalu na poziomie 1 fM.

Schemat budowy bioelektronicznego nosa przedstawiono na Rysunku 5.


Rysunek 5. Schematyczne przedstawienie sposobu generowania sygnałów i ich przekazywania w komórkach i nanopęcherzykach. Sztuczna komórka węchowa zbudowana jest z białek niezbędnych do przekazywania sygnału, takich jak receptory węchowe, białka G, cyklazy adenylowe, kanały jonowe w błonie komórkowej (A). Nanopęcherzyki węchowe wytwarzane są z komórek węchowych z wykorzystaniem cytochalazyny B (B). Końcowym etapem budowy bioczujnika jest osadzenie wytworzonych nanopęcherzyków na nanorurkach węglowych i odpowiednim tranzystorze (C). Kontakt określonego odoranta z receptorem zapachowym skutkuje generowaniem sygnału, który jest następnie odpowiednio przetwarzany (D).


Podsumowanie
Analiza substancji zapachowych jest coraz częściej realizowana z wykorzystaniem enosów. Jedną z głównych zalet tych urządzeń jest możliwość pominięcia wstępnego etapu przygotowania próbek do analizy oraz możliwość stosowania w terenie. Utrudnienia związane z używaniem klasycznych metod analizy zapachów mogą być wyeliminowane poprzez zastosowanie urządzeń pozwalających na szybką i niewymagającą wysokich kosztów analizę odorów. Liczne doniesienia literaturowe odnoszące się do teoretycznych podstaw działania elektronicznych nosów i praktycznych możliwości ich zastosowania są podstawą do stwierdzenia, że rozwój analityki zapachów jest związany z wykorzystaniem enosów. Oczekuje się, że w najbliższych latach dynamiczny postęp w dziedzinie urządzeń z grupy elektronicznych nosów przyczyni się do rozwoju analityki zapachów. Komercjalizacja tego typu urządzeń i ich dostępność w handlu, jako rzeczywistej alternatywy dla klasycznych metod analizy zapachów, może już niedługo być realną perspektywą. Kombinacja biomateriałów z czujnikami gazowymi ma duży potencjał lub nawet może zrewolucjonizować obszary, gdzie wykorzystywana jest bardzo specyficzna i czuła analiza substancji zapachowych.