Bartłomiej Kraska
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe, Lipopharm.pl
strony wersji drukowanej: 4-7


W obecnych czasach trudno wyobrazić sobie prowadzenie badań naukowych bez odpowiedniego sprzętu laboratoryjnego. Niniejszy przewodnik zakupu sprzętu HPLC wskaże różnice w elementach oraz założenia jakie trzeba podjąć. Począwszy od prostych urządzeń laboratoryjnych jak mieszadło czy wirówka, po zaawansowany sprzęt taki jak różnego rodzaju spektrometry. Od posiadanego sprzętu bądź też swobodnego do niego dostępu często zależy sukces zespołu naukowego. Kiedyś jako luksus, dziś jako narzędzie wręcz niezbędne w laboratorium analitycznym oraz preparatywnym, stanowi wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC). Mnogość opcji zakupu może sprawić duże trudności przede wszystkim osobom nie mającym wcześniej z takim urządzeniem styczności. Praktyka pokazuje, że w wielu miejscach spotkać można urządzenia HPLC posiadające funkcje, z których nikt nigdy nie skorzystał i najprawdopodobniej nie zrobi tego w przyszłości. Zdarza się nawet, że właściciel urządzenia nie jest świadom potencjału swojego sprzętu. Natomiast część wydanych niepotrzebnie środków można było przeznaczyć na inny, bardziej potrzebny sprzęt. Tak więc z opcji kupna najwyższej klasy urządzenia „na zapas” powinny przystać tylko bogate instytucje. Dobór sprzętu pod wieloma względami przypomina zakup samochodu. Można oczywiście kupić Ferrari pod wpływem niespodziewanego przypływu gotówki. Należy jednak wziąć pod uwagę późniejsze utrzymanie tego auta oraz fakt, że i tak nie będzie można wykorzystać ponadprzeciętnych jego parametrów.

Wykorzystanie sprzętu
Aby rozsądnie wykorzystać środki na zakup HPLC należy przede wszystkim ocenić co jest potrzebne, ale również zastanowić się do jakich zastosowań sprzęt nam posłuży w przyszłości. Istotnym czynnikiem będzie też charakter pracy, czy będą to precyzyjne oznaczenia analityczne, a może proste badanie czystości np. syntezowanych związków chemicznych. Inne wymagania stawiane są chromatografom stosowanym w przemyśle, inne urządzeniom pracującym w laboratoriach badawczych uczelni a jeszcze inne HPLC kupuje się dla zajęć studenckich. Należy pamiętać przy tym, że chromatografy wymagają serwisowania i wymiany elementów zużywalnych. Nagły brak środków na te cele może uniemożliwić kontynuację podjętych prac, a w skrajnych przypadkach zatrzymać pracę całego laboratorium.

Komponenty HPLC
Typowy zestaw HPLC składa się z jednej lub dwóch pomp wysokociśnieniowych (z mieszalnikiem), dozownika i detektora. Badany związek trafia poprzez dozownik, niesiony fazą ruchomą na kolumnę, gdzie na zasadzie wykorzystywania różnych zjawisk (np. adsorpcja, wymiana jonowa), ulega rozdzieleniu na złożu i w różnej kolejności opuszcza kolumnę. Eluat monitoruj się za pomocą detektora podłączonego do komputera, co ułatwia znacznie archiwizację danych. W zestawach stosuje się jedną lub dwie pompy HPLC, zwykle o przepływach 0,01-10 ml/min. Stosując jedną pompę można uzyskać wyłącznie rozdziały izokratyczne (cały czas płynie ten sam eluent) lub w przypadku wyposażenia pompy w zawory elektromagnetyczne uzyskać tzw. gradient niskociśnieniowy. Gradient wysokociśnieniowy uzyskuje się poprzez niezależną pracę dwóch lub więcej pomp izokratycznych. Zestaw izokratyczny jest na początek pracy z HPLC najtańszym rozwiązaniem. Urządzenie takie można już kupić za 35 tyś PLN. Z powodzeniem można analizować na nim znane związki bazując na ich monografiach. Jednak nadaje się on tylko tam gdzie używa się zazwyczaj tej samej metody (składu fazy ruchomej). Dla każdej nowej, nieznanej substancji trzeba żmudnie, najczęściej metodami prób i błędów, szukać właściwego składu fazy ruchomej. Użytkownik musi się często „wstrzelić” w warunki, co nie jest proste.  W przeciwnym przypadku analizowane substancje zostaną wypłukane z kolumny z objętością martwą lub  zatrzymane na złożu, czyli w obu przypadkach nie ulegną rozdzieleniu. W zestawie gradientowym jest pełna kontrola nad składem fazy ruchomej w czasie i można swobodnie dobierać nowe warunki w oparciu o dwa lub więcej eluenty. Analizowane próbki wprowadza się na kolumnę za pośrednictwem dozownika. W przypadku dozowników ręcznych przydatną funkcją jest tzw. autostart, który umożliwia automatyczne uruchamianie pomiaru natychmiast po nastrzyknięciu próbki. Bardzo ważnym elementem dozownika jest pętla nastrzykowa. Pętla określa jaką maksymalną objętość próbki można jednorazowo nanieść na kolumnę. W celach analitycznych należy stosować pętle w miarę krótkie, o niewielkiej objętości (zwykle 20 µl) a celach preparatywnych części powyżej 1 ml. Dobrym, ale drogim rozwiązaniem jest zastosowanie automatycznego podajnika próbek, autosamplera. Niewątpliwą zaletą autosamplerów jest możliwość częściowej bądź pełnej automatyzacji pracy w laboratorium. Pozwala on na zaprogramowanie kilkudziesięciu analiz. Możliwość pracy w nocy i w dni wolne od pracy powoduje, że zestaw HPLCjest w pełni wykorzystany. Wadą automatycznych podajników jest jednak koszt, sięgający 30-50 tyś PLN oraz ewentualna awaryjność. Bardzo ważnym elementem każdego zestawu HPLC jest detektor. Umożliwia to monitorowanie co wychodzi z kolumny chromatograficznej. Wybierając właściwy detektor należy pamiętać, że nie jest to element tani i trzeba o niego dbać. Detektory za sprawą często skomplikowanej elektroniki, czułe są na skoki napięcia a do elementów szczególnie delikatnych mechanicznie należy sama cela  pomiarowa podatna na potencjalne zabrudzenia. W zależności jakie przepływy się stosuje w detektorach montuje się cele analityczne lub preparatywne. Na rynku dostępnych jest szereg detektorów HPLC. Najbardziej uniwersalnym jest detektor spektrofotometryczny wykorzystujący promieniowanie UV-Vis. Warunkiem, aby badane związki były widzialne muszą one posiadać w swej strukturze chromofory. Najtańszym modelem jest detektor bez możliwości zmiany fali. Wybierając filtr np. 254nm można z powodzeniem badać związki posiadające ugrupowania aromatyczne. Odmianą detektora UV-Vis jest też detektor z matrycą diodową (DAD) obrazujący całe spektrum promieniowania w jakim był badany związek. Do większości analiz wystarcza zakres 200-300nm.  Na rynku podstępnych jest szereg innych detektorów do różnych zastosowań. Są to detektory fluorescencyjne, refraktometryczne, elektrochemiczne, detektory rozproszenia laserowego, czy masowe.  

Kolumna chromatograficzna
Jednym z podstawowych warunków, aby odnieść sukces podczas pracy z HPLC jest odpowiednia kolumna. Niestety nie istnieją kolumny uniwersalne. Co więcej różne kolumny charakteryzują się wieloma parametrami co nie ułatwia wyboru najwłaściwszej kolumny dla wykonywanych doświadczeń. Podstawową różnicą jest rodzaj złoża jakimi są wypełnione. Zwykle złoże kolumny stanowi krzemionka o średnicy ziaren 3 lub 5µm. Złoże to jest modyfikowane odpowiednimi ugrupowaniami chemicznymi. Najczęściej stosuje się ugrupowania oktylowe (C8) oraz oktadecylowe (C18). Wypełnienia te stosowane są w ponad połowie kolumn sprzedawanych na świecie. Wybór kolumny podyktowany jest głównie charakterystyka związków, które mają być oznaczane. Inne kolumny należy zastosować do peptydów, inne do tłuszczy, a jeszcze inne do polimerów. W ofercie znajdują się także kolumny do zadań specjalnych, np. rozdziału związków chiralnych czy też związków silnie polarnych (kolumny HILIC). Sytuacja komfortowa jest, gdy eksperymentator ma szczęście zajmować się tylko jedną, określoną grupą związków chemicznych to wybór odpowiedniej kolumny nie jest kłopotliwy. W zupełności wystarczy jedna niedroga, oczywiście pod warunkiem przestrzegania zasad odpowiedniej pracy oraz jej konserwacji. Jeżeli zaś praca w laboratorium ma charakter wszechstronny to niezbędne będzie zaopatrzenie się także w inne rodzaje kolumn, których ceny dochodzą nawet do kilkunastu tysięcy złotych. Należy jednak uważać na różnego typu „cudowne” wynalazki, gdzie producenci obiecują rewelacyjnie krótkie analizy w porównaniu do kolumn standardowych, gdyż aby osiągnąć takie rezultaty potrzebne są niekiedy specjalne parametry sprzętu HPLC oraz warunki rozdziału którym nie będziemy w stanie sprostać. Aby wydłużyć żywotność kolumn należy przestrzegać określonych zasad. Przede wszystkim nie należy stosować wyższych przepływów niż takich do jakich kolumna jest przystosowana. W przeciwnym przypadku złoże może zostać bezpowrotnie uszkodzone. Podobnie stanie się gdy przekroczy się odpowiednią wartość temperatury oraz pH fazy ruchomej. Dodatkowo niektóre kolumny (np.  kolumny monolityczne) wrażliwe są na wstrząsy wywołane upadkiem lub uderzeniem. Sprawność kolumny można też łatwo utracić nanosząc wraz z analitem zanieczyszczenia lub też badając substancje niewskazane dla danego złoża. Może się również zdarzyć, że pewne związki dosłownie zaklejają kolumnę, czasem nawet uniemożliwiając jej odblokowanie. Często kolumny chronione są za pomocą prekolumny pełniącej rolę filtra. Pomimo że „zmęczoną” kolumnę można poddać procesowi regeneracji, warto mieć zaplanowany w budżecie zakup chociażby używanej, sprawnej kolumny.

Odgazowywanie eluentów oraz termostatowanie kolumny
Przygotowując eluenty stanowiące fazę ruchomą należy zadbać o ich dostateczne odgazowanie. W tym celu można eluent poddać działaniu ultradźwięków lub odgazować z wykorzystaniem helu. Opcjonalnie można zastosować profesjonalny degazer wbudowany w urządzenie. Analizy HPLC są czułe na zmiany temperatury i większość analiz powinna być wykonywania w warunkach stałej temperatury. Podobnie, jeśli istnieje obawa o możliwość krystalizacji analizowanych związków niskiej temperaturze. Oferta tych urządzeń jest obecnie na rynku bardzo bogata i znalezienie czegoś w rozsądnej cenie nie powinno stanowić większego problemu.

Oprogramowanie
Program obsługujący sterujący urządzeniami HPLC oraz zbierający i przetwarzający dane jest drogim, ale niezbędnym elementem każdego współczesnego zestawu. Zwykle chromatografy pracują tylko z dedykowanym oprogramowaniem oferowanym przez producenta. Zdarza się że potencjalni klienci rezygnują z zakupu danego modelu właśnie przez nieintuicyjne, trudne w obsłudze i to nawet przez kwalifikowany serwis oprogramowanie. Inne oprogramowanie jest zalecane do przemysłu, inne (zwykle dużo uboższe) dla instytucji naukowych. Nie warto przepłacać i kupić to, co jest naprawdę potrzebne, gdyż cena oprogramowani stanowi zwykle nawet 10-20% ceny całego zestawu HPLC.

Koszty stałe i nieoczekiwane
Pomimo, ze urządzenia HPLC zwykle nie ulegają częstym awariom, wymagają jednak drobnych naprawa i przeglądów serwisowych. W urządzeniach modułowych wiele czynności serwisowych można wykonać na własną rękę. Należy wziąć jednak pod uwagę potrzebę ewentualnego wezwania autoryzowanego serwisu. Podczas zakupu wydaje się za kluczowe poznanie cennika oraz sposobu realizacji zleceń napraw przez poszczególne firmy. Sama robocizna napraw serwisowych może być w standardowej cenie (200-300 PLN/h) jednak dojazd do miejsca naprawy może wynieść nawet kilkakrotnie więcej. Do najczęściej wymienianych elementów HPLC należą lampa detektora oraz zawory głowic pomp. Lampy do detektorów UV mają gwarancję działania obliczoną zwykle na 1000-2000 godzin i kosztują, w zależności od modelu i producenta, około 2000 PLN. Do kosztów stałych należy także zaliczyć organiczną fazę ruchomą oraz filtry strzykawkowe, które stosuje się dla zwiększenia żywotności kolumny. Do nieoczekiwanych kosztów należy zaliczyć uszkodzenia kolumny na wskutek niewłaściwego użytkowania, uszkodzenia sprzętu poprzez drgania i wibracje czy zatarcie głowicy i uszczelek pompy przez niedopilnowanie uzupełnienia eluentu, bądź wykrystalizowania soli z roztworów buforowych, używanych jako modyfikatorów fazy ruchomej. Myśląc o zakupie zestawu HPLC warto pamiętać o tym, że na jakość uzyskiwanych wyników duży wpływ będzie miała czystość używanych rozpuszczalników, w tym szczególnie wody. Woda stanowi podstawę w chromatografii faz odwróconych, dlatego na etapie planowania należy zdecydować czy regularnie będzie się kupowało wodę o jakości HPLC w butelkach, czy zakupiony zostanie zestaw do oczyszczania wody. Decyzja powinna opierać się o prognozę ilości analiz.

Nowy czy używany ?
Wybór czy sprzęt ma być nowy, czy używany zależy głownie od budżetu. Trzeba sobie jednak zdać sprawę, że starszy nie zawsze znaczy gorszy. Zwykle silnik, elektronika oraz obudowa bardzo rzadko ulegają zużyciu, natomiast elementy zużywalne takie jak lampa UV czy zawory należy wymieniać z podobną częstością w obu wypadkach. Do dziś dnia w wielu laboratoriach z łatwością można znaleźć sprawne urządzenia sprzed 20-30 lat. Niekiedy więc zakup dwóch „używek” może okazać się lepszym pomysłem niż jednego egzemplarza nowego, dzięki czemu w laboratorium może pracować więcej niż jedna osoba lub można wykonywać powierzone zadania szybciej przy wykorzystaniu dwóch maszyn jednocześnie.

Jaka firma ?
Najczęściej zadawane pytanie przed zakupem chromatografu dotyczy najlepszego producenta sprzętu. Odpowiedź nie jest łatwa. W obrębie jednej firmy pojawiają się modele lepsze bądź gorsze, intuicyjne lub też niewygodne. Nie zawsze należy kupować najdroższe modele aby analizy były solidnie wykonane. Często o zadowoleniu klienta decyduje odpowiednie podejście serwisu. Powszechnie wiadomo, ze każde HPLC ulega drobnym lub poważniejszym awariom. Odpowiednia reakcja serwisu, podejście do użytkowników oraz przystępne ceny napraw są czynnikiem decydującym o wybraniu takiej a nie innej firmy. Trudne jest także zasięganie opinii osób trzecich lub pytanie o opinię sprzedawców sprzętu. Przedstawiciele handlowi będą chwalić tylko i wyłącznie oferowany sprzęt.