MS-ExpertTomasz Bieńkowski
MS Ekspert Sp. z o.o.
tomasz.bienkowski@msekspert.com



Spektrometria ruchliwości jonów (IMS ang. Ion Mobilty Spectrometry) jest techniką, w której zjonizowane substancje są rozdzielane na podstawie ich przekroju czynnego σ (oznaczenie symbolem σ jest zgodne z nomenklaturą IUPAC, jednak w niektórych materiałach można spotkać się z wcześniej wykorzystywanym symbolem Ω). Przekrój czynny cząsteczki jest zależny między innymi od jego wielkości tak, że im większa jest cząsteczka, tym większa jest jej wartość σ. Dodatkowo, zależy on od masy jonu, ładunku i od kształtu cząsteczki. Z tego powodu jest on wartością charakterystyczną zjonizowanej substancji. Przekrój czynny  jest odwrotnie proporcjonalny do ruchliwości jonów K, która zależy od przekroju czynnego i parametrów urządzenia na którym wykonywane są pomiary. Wymienione cechy powodują, że spektrometria ruchliwości jonów zapewnia inną selektywność niż spektrometria mas. Rozdzielenie jonów następuje w polu elektrostatycznym w wyniku licznych zderzeń z cząsteczkami gazu obojętnego znajdującego się w analizatorze. Technika ta znana jest od lat 70., kiedy to była jeszcze nazywana chromatografią plazmową. Wtedy też powstały urządzenia pozwalające na szybką analizę lotnych związków organicznych. Ponieważ IMS może działać pod ciśnieniem atmosferycznym, nie wymaga stosowania pomp próżniowych tak jak to ma miejsce w spektrometrii mas, która wymaga wysokiej próżni. Urządzenia wykorzystujące IMS do identyfikacji związków są więc znacznie mniejsze i często przenośne. IMS jest powszechnie wykorzystywany do rutynowych analiz w wojsku, na lotniskach do szybkiej identyfikacji nielegalnych substancji oraz w przemyśle farmaceutycznym przy walidacji czyszczenia. Są to jednak urządzenia urządzenia relatywnie proste o niskiej rozdzielczości.

W obecnej chwili spektrometria ruchliwości jonów rozwinęła się w takim stopniu, że może stanowić konkurencję dla systemów HPLC-UV, zostać wykorzystana jako detektor w chromatografii cieczowej lub w sprzężeniu ze spektrometrem mas zwiększyć możliwości analityczne techniki LC/MS.

W komercyjnych systemach dostępne są cztery rodzaje analizatorów służących do rozdzielania jonów na podstawie przekroju czynnego.

Klasyczne analizatory IMS wyposażone są w komorę dryftu DT IMS (ang. Drift Time Ion Mobility Spectrometry). Zjonizowane cząsteczki analitów w momencie otwarcia bramki impulsowej przyspieszane są w polu elektrostatycznym. W przeciwną stronę do kierunku ich przemieszczania może być skierowany strumień gazu (zazwyczaj jest to powietrze i pomiary prowadzi się pod ciśnieniem atmosferycznym). Większe cząsteczki, o większej wartość σ zderzają się częściej z obojętnymi cząstkami gazu, przez co przemieszczają się przez komorę dryftu wolniej i później docierają do detektora. Stąd, czas dryftu jest proporcjonalny do przekroju czynnego cząsteczki i może posłużyć do jej wyznaczenia. Mimo to, możliwość ta nie jest wykorzystywana w rutynowych analizach. W obecnej chwili metody pomiarowe dostarczają dokładniejszych informacji na temat przekroju czynnego, niż metody obliczeniowe. Można w przybliżeniu wyznaczyć wartość σ, ale potrzebne są do tego skomplikowane obliczenia związane z modelowaniem molekularnym. Ponieważ na podstawie budowy cząsteczki w prosty sposób nie da się policzyć wartości σ, dlatego zazwyczaj w IMS podaje się charakterystyczne dla danego związku czasy dryftu. Warto tu przy okazji przypomnieć, że wartość σ jest charakterystyczna dla danej substancji, natomiast czas dryftu i związana z nim ruchliwość jonów jest specyficzna dla danego urządzenia i metodyki pomiarowej.

IMS DT można porównać do uproszczonej wersji spektrometru mas, ponieważ w fazie gazowej rozdzielamy jony na podstawie ich ruchliwości, natomiast wynik pomiaru, widmo IMS zdecydowanie lepiej porównać do chromatogramu uzyskanego na systemie HPLC (Rysunek 1).


Rysunek 1. Przykładowe widmo IMS dla koenzymu Q10 wykonane na aparacie GA2100 firmy Excellims. Materiały firmy Excellims.


Dla danego systemu wyposażonego w zdefiniowany układ pomp i kolumnę, w przypadku gdy komponenty będą pochodzić od jednego producenta, zmierzone czasy retencji będą zbliżone, jeśli zastosujemy sprzęt pochodzący od innego producenta, różnice mogą być większe. Podobne zasady obowiązują w IMS, z tym że czas pomiaru jest znacznie krótszy i wynosi kilkadziesiąt milisekund. Pojedynczy pomiar jest bardzo krótki, ale zazwyczaj do wykonania pomiaru ilościowego lub jakościowego uśrednia się sygnał przez kilka sekund. Parametrem opisującym system IMS jest rozdzielczość procesu rozdzielna jonów.  Definiowana jest jako stosunek szerokość sygnału w połowie wysokości do jego czasu dryftu. W większości komercyjnych systemów wykorzystujących ruchliwość jonów do analizy ilościowej lub identyfikacji stosuje się komorę dryftu. Nowoczesne systemy ruchliwości jonów, wyposażone w ten klasyczny analizator, osiągają rozdzielczość sięgającą 100 i nazywane są czasami (HPIMS ang. High performance Ion mobility spectrometry).

MS-Expert
Bardzo ciekawym rozwiązaniem jest produkt oferowany przez firmę Excellims. Sprzedawany przez nich system może być wyposażony w źródło do termodesorpcji za pomocą którego można analizować próbki stałe jak i gazowe. Może być również wyposażony w źródło elektrosprej do próbek ciekłych. W przeciwieństwie do pozostałych, komercyjnie dostępnych systemów, umożliwia opracowywanie własnych metod analitycznych. Może być również wykorzystany jako detektor do HPLC. System ten może znalazł zastosowanie w analizie żywności, ochronie środowiska, kryminalistyce. Jego największą zaletą jest wysoka czułość i krótki czas pomiaru. IMS wykorzystujący komorę dryftu może być również połączony ze spektrometrem mas, zazwyczaj wysokiej rozdzielczości. Komora dryftu znajduje się między źródłem jonów, a próżniową częścią spektrometru. Dzięki temu powstające w źródle jony, przed analizą w spektrometrze mas, mogą być wstępnie rozdzielone na podstawie ich przekroju czynnego. Zwiększa to selektywność układu LC/MS. Jest to szczególnie przydatne w aplikacjach, gdzie mamy do czynienia z wieloma izomerycznymi związkami, na przykład w lipidomice. Przykładem takiego rozwiązania jest spektrometr QqTOF, model 6560 firmy Agilent, dostępne są również przystawki wykorzystujące ten typ analizatora IMS, które można wykorzystywać ze spektrometrami mas innych producentów. Najciekawszym rozwiązaniem, oferującym znakomite parametry jest system IMS-TOF firmy TOFwerk.

Jest to analizator, który łącząc dwie techniki, zwiększa w zdecydowany sposób ich możliwości. Największą wadą komory dryftu jest niska wydajność wykorzystania jonów. W momencie gdy trwa pomiar czasu dryftu jonów, w klasycznych systemach powstające w tym czasie w źródle jony są tracone. Wydajność takich systemów wynosi około 1%, to znaczy, taki odsetek ze wszystkich wytworzonych jonów trafia do detektora. W przypadku systemu IMS-TOF, aby zwiększyć wydajność analizatora stosowana jest sekwencja Hadamarda otwierania bramki. W klasycznym DT IMS bramka otwiera się tylko raz na cykl i jony o różnej ruchliwości po różnym czasie docierają do detektora. W przypadku sekwencji Hadamarda bramka wpuszczająca jony do komory otwiera się z częstotliwością kilkudziesięciu Hz na zróżnicowany czas mierzony w µs Rysunek 2.


Rysunek 2. Porównanie sekwencji otwierania bramki w klasycznym systemie DT IMS i IMS-TOF. Materiały firmy TOFWERK.


W czasie pomiaru jony o różnej ruchliwości mieszają się ze sobą. Jednakże zamiast tradycyjnego detektora, który mierzy ilość docierających do niego jonów w jednostce czasu, mamy analizator czasu przelotu. Umożliwia on bardzo szybki pomiar zarówno ilości jonów jak i ich dokładnej masy, dzięki czemu możemy wyznaczyć czas dryftu poszczególnych jonów. Analizator TOF jest znacznie szybszy od IMS, działa z częstotliwością 100 kHz, możemy więc z bardzo dużą częstotliwością mierzyć jakie jony docierają do detektora. Ponieważ znamy okres na jaki otwierana była bramka i bardzo dokładnie mierzymy, po jakim czasie i przez jaki okres dany jon docierał do analizatora TOF, możemy odtworzyć pełne widmo IMS. Wydajność tak działającej komory dryftu sięga 50%. Co równie ważne, ponieważ znamy sekwencje otwierania bramki, wiemy też przez jaki czas jony o danym przekroju czynnym powinny docierać do detektora. Sygnały mierzone na skutek wielu procesów zachodzących w komorze dryftu są poszerzone, ale ponieważ znamy ich teoretyczną szerokość i dla każdego rodzaju jonu mamy zmierzone kilkadziesiąt sygnałów w jednym cyklu, możemy wyliczyć teoretyczną szerokość sygnału (Rysunek 3).


Rysunek 3. Metoda wyostrzania pików stosowana w systemie IMS-TOF. Materiały firmy TOFWERK.


Umożliwia to zwiększenie rozdzielczości IMS do wartości przeszło 200 oraz zmniejszenie szumu. System IMS-TOF, dzięki połączeniu możliwości dwóch rodzajów analizatorów, zapewnia więc znacznie większą czułość pomiarów i rozdzielczość niż systemy DT IMS.

Kolejny typ analizatora ruchliwości jonów, oparty jest na optyce jonowej wykorzystującej  przemieszczająca się fale (TW IMS ang. Travelling Wave Ion Mobility Spectrometry). Komercyjnie dostępny jest w połączeniu z spektrometrem mas w systemach firmy Waters. Są to spektrometry typu QqTOF i analizator ruchliwości znajduje się pomiędzy kwadrupolowym analizatorem mas a przed komorą zderzeń i analizatorem czasu przelotu. Pracuje on pod obniżonym ciśnieniem, ponieważ znajduje się wewnątrz próżniowej części spektrometru. Element optyki jonowej wykorzystując przemieszczającą się falę, zbudowany jest z szeregu pierścieniowych elektrod (Rysunek 4).


Rysunek 4. Na górze budowa jonowodu umożliwiającego wytworzenie przemieszczającej się fali. Na dole, transmisja jonów za pomocą przemieszczającej się fali.
Materiały firmy Waters.


Dostarczane jest do nich zarówno napięcie zmienne o częstotliwości radiowej jak i stałe. Napięcie zmienne utrzymuje jony wewnątrz optyki jonowej nie pozwalając im poruszać się ortogonalnie do kierunku przemieszczania się. Potencjał napięcia stałego przykładany jest od elektrod, tworząc barierę potencjału utrzymującą jony pomiędzy wybranymi elektrodami. Potencjał ten krokowo przesuwany jest pomiędzy kolejnymi elektrodami, w ten sposób, jony przemieszczają się wzdłuż jonowodu (Rysunek 4).

Takie rozwiązanie zapewnia wysoko wydajną transmisję jonów w próżni, umożliwia w połączeniu z kwadrupolem zwiększyć wydajności skanowania, a w przypadku ciśnienia zapewniającego odpowiednią ilość zderzeń, umożliwia rozdzielanie jonów na podstawie ich przekroju czynnego. Mechanizm tego rozdzielnia jest bardzo złożony i nie do końca poznany (Fundamentals of Traveling Wave Ion Mobility Spectrometry A. A. Shvartsburg, R. D. Smith  Anal Chem. 2008 Dec 15; 80(24): 9689–9699.). TW IMS umożliwia rozdzielania jonów na podstawie ich ruchliwości, rozdzielczość tego typu analizatora sięga 40. Przy pomocy tej techniki możliwe jest również wyznaczanie wartości przekroju czynnego jonów. Wymaga to jednak wielopunktowej kalibracji i zależy od grup funkcyjnych występujących w badanych związkach. Kalibracje powinno się więc przeprowadzać przy pomocy związków podobnych do badanych. Ponieważ TW IMS znajduje się przed analizatorem czasu przelotu, zanim jony zostaną poddane analizie na podstawie ich stosunku masy do ładunku, można je wstępnie rozdzielić na podstawie przekroju czynnego. W ten sposób, można zwiększyć selektywności całego systemu LC/MS. Z racji zastosowanych technologii rozwiązanie to przydatne jest głównie w analizie jakościowej i profilowaniu związków.

W przypadku analizatorów IMS wykorzystujących silne, zmienne pole elektrostatyczne (FAIMS ,ang. High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry, nazwa ta wykorzystywana jest w rozwiązaniach firmy Thermo i Owlstone), nazywanych również różnicową ruchliwością jonów (DMS, ang. Differential Ion Mobility Spectrometry, nazwa wykorzystywana jest w rozwiązaniach firmy SCIEX) nie ma możliwości wyznaczania przekroju czynnego jonów. Urządzenia te pozwalają rozdzielić jony o różnej ruchliwości, ale działają bardziej na zasadzie filtra, a nie pełnego analizatora. Na rynku dostępne są rozwiązania o różnej geometrii, zasada działania ich jest jednak podobna. Analizator znajduje się pomiędzy źródłem jonów a próżniową częścią spektrometru. Powstające w źródle jony dostają się pomiędzy dwie metalowe płytki, do których przyłożone jest napięcie zmienne o częstotliwości radiowej, oraz napięcie stałe. Napięcie zmienne odpowiedzialne jest za rozdzielenie jonów na podstawie ich ruchliwości, napięcie stałe umożliwia jonom o wybranym przekroju czynnym zachować stabilną trajektorię lotu i przedostać się do dalszej części spektrometru. Przy danym układzie napięć jony o specyficznej ruchliwości zachowują stabilną trajektorię lotu (Rysunek 5).


Rysunek 5. Zasada działania systemów IMS wykorzystujących zmienne pole elektrostatyczne. Materiały firmy SCIEX.


W trakcie procesu rozdzielania jonów w tego typu analizatorze zmienia się natężenie pola elektrostatycznego. Powoduje to cykliczne tworzenie i rozpadanie się klasterów analitów z cząsteczkami rozpuszczalnika obecnymi w fazie gazowej. Na skutek tego zjawiska w analizatorach ze zmiennym polem elektrostatycznym obecność cząsteczek rozpuszczalnika w fazie gazowej może bardzo zmieniać wydajność procesu rozdzielania jonów. Dlatego też w niektórych komercyjnych rozwiązaniach istnieje możliwość dodawania do fazy gazowej par wybranych rozpuszczalników. Zazwyczaj są to rozpuszczalniki używane w analizie LC/MS takie jak 2-propanol, acetonitryl lub metanol (B.B. Schneider, T.R. Covey, S.L. Coy, E.V. Krylov, and E.G. Nazarov, Anal. Chem. 2010, 82, 1867-1880). W technice tej bardzo trudno przewidzieć jaka modyfikacja fazy gazowej będzie najlepsza do rozdzielenia interesujących nas związków i jakie napięcia potrzebne są do wydajnej transmisji jonów. Parametry te muszą być optymalizowane dla każdego analitu. Różnicowa ruchliwość jonów najlepiej sprawdza się jako dodatek do spektrometrów typu potrójny kwadrupol. Optymalizując parametryrzejścia MRM dla analizatorów masy możemy równocześnie dobrać parametry pozwalające na wydajną transmisję jonów po przez filtr DMS. Wydajność procesu rozdzielania jonów na podstawie przekroju czynnego nie jest duża i sięga 10%, zmniejsza się więc ilość jonów docierająca do detektora. Jednakże, w przypadku gdy udaje się zwiększyć selektywność układu LC/MS, możliwe jest uzyskanie niższych limitów detekcji. Stosowanie dodatkowego filtra ruchliwości jonów ma sens tylko w przypadku, gdy przejścia MRM są zbyt mało selektywne. Im bardziej czuły jest potrójny kwadrupol, tym bardziej przydatne może być zastosowanie ruchliwości jonów jako dodatkowego filtra, ponieważ rośnie ryzyko interferencji. Zastosowanie spektrometru typu potrójny kwadrupol, opisany tryb pracy oraz obserwowanie przejść MRM wskazuje, że analizatory ruchliwości jonów wykorzystujące zmienne pole elektrostatyczne najlepiej sprawdzają się w analizie ilościowej.

Można próbować je wykorzystać w analizie jakościowej. Skanowanie za pomocą systemu FAIMS polega na zmienianiu w sposób dyskretny wartości napięcia stałego, umożliwia to jonom o różnej ruchliwości przedostanie się do spektrometru. Tak jak w przypadku analizatorów kwadrupolowych, skanowanie jonów będzie jednak bardzo mało wydajne i na dodatek wolniejsze, niż w przypadku pozostałych opisanych w tym artykule analizatorów ruchliwości jonów. Rozdzielczość tego typu analizatorów może dochodzić do 100, ale bardzo zależy od struktury zjonizowanych substancji.

Stosunkowo najnowsze rozwiązanie to pułapkująca spektrometria ruchliwości jonów (ang. TIMS, Trapped Ion Mobility Spectrometry). Jest to rozwiązanie wprowadzone na rynek przez firmę Bruker w aparacie TimsTOF (Fundamentals of Trapped Ion Mobility Spectrometry K Michelmann, Joshua A. Silveira, Mark E. Ridgeway, Melvin A. Park, J. Am. Soc. Mass Spectrom. (2015) 26:14-24). Analizator ten umieszczony jest za źródłem jonów w niskociśnieniowej części spektrometru, przed analizatorami mas w spektrometrze wysokiej rozdzielczości. Budowa analizatora bardzo przypomina lejek jonowy, który wykorzystywany jest w optyce jonowej aby zwiększyć wydajność transmisji jonów w spektrometrach mas. TIMS składa się szeregu elektrod podzielonych na trzy sektory, lejka wlotowego, tunelu TIMS i lejka wylotowego (Rysunek 6).


Rysunek 6. Budowa analizatora TIMS.


W tunelu, przestrzenie między elektrodami są wypełnione tak aby zapewnić laminarny przepływ gazu. Kierunek przepływu gazu jest odwrotny to kierunku gradientu pola elektrostatycznego w tunelu TIMS. Do elektrod przyłożone jest napięcie zmienne utrzymujące jony wewnątrz optyki jonowej nie pozwalając im opuścić analizatora ortogonalnie do kierunku przemieszczania się. Dodatkowo za pomocą stałego napięcia wytwarzany jest gradient pola elektrostatycznego budujący barierę potencjału nie pozwalającą jonom na dalsze przemieszczanie do wnętrza spektrometru. Rozdzielenie jonów na podstawie przekroju czynnego odbywa się w tunelu. W miejscu, w którym bariera potencjału równoważona jest przez siłę wywieraną przez strumień płynącego gazu, jony o specyficznej wartości σ są wyłapywane. W ten sposób jony o różnej ruchliwości są rozdzielane wzdłuż tunelu TIMS. Proces rozdzielania i wyłapywania jonów jest szybki i zajmuje kilka milisekund. Po rozdzieleniu jonów na podstawie ich wartości ruchliwości jonów obniżana jest bariera potencjału i w ten sposób jony o różnej wartości przekroju czynnego mogą być rozdzielane przez analizatory masy. Po cyklu wyłapywania jonów, tylko w momencie gdy z analizatora selektywnie usuwane są jony o specyficznej ruchliwości, powstające w źródle jony są tracone. TIMS umożliwia więc wysoką wydajność transmisji jonów a więc również wysoką czułość pomiarów. Co bardzo ważne, ten rodzaj analizatora zapewnia też wysoką rozdzielczość sięgającą 200. Jest to najnowsze i jedno z bardziej interesujących rozwiązań umożliwiających sprzężenie ruchliwości jonów ze spektrometrią mas. Wydaje się być bardzo dobrym rozwiązaniem zwiększającym możliwości analizy jakościowej za pomocą systemu LC/MS.

Podsumowując, należy stwierdzić, że ruchliwość jonów w coraz częściej zaczyna być wykorzystywana w połączeniu ze spektrometrami mas. Ponieważ analizatory te są znacznie szybsze niż rozdzielanie związków za pomocą chromatografii cieczowej, pojawia się możliwość znacznego skrócenia czasu pomiarów w przypadku niezbyt skomplikowanych matryc. Ruchliwość jonów zwiększa selektywność spektrometru mas. Podstawą rozdzielania jonów jest przekrój czynny zjonizowanych substancji, który zależy od struktury związku. IMS umożliwia rozdzielenie izomerów, które jeśli fragmentują w ten sam sposób, są nierozróżnialne przez spektrometr mas. Czym bardziej różni się struktura przestrzenna izomerów, tym większa jest szansa że uda się je rozdzielić za pomocą różnic w ich przekroju czynnym. Ograniczenie do niezbyt skomplikowanych matryc wynika z faktu, że analizator IMS znajduje się za źródłem jonów. Bezpośrednie dozowanie bardzo złożonych próbek, powoduje znaczne zmniejszenie wydajności jonizacji źródła oraz zmniejszenie powtarzalności pomiarów. W połączeniu z selektywnym przygotowaniem próbek lub metodą jonizacji mniej wrażliwą na efekt matrycy, IMS-MS wydaje się być doskonałym narzędziem do wysokoprzepustowej, rutynowej analizy umożliwiającej wykonanie setek pomiarów w ciągu godziny.


Zapraszam do zadawania pytań:
tomasz.bienkowski@msekspert.com