Wojciech Kamysz, Daria Grzywacz
Laboratorium Syntezy Peptydów, Lipopharm.pl
strony wersji drukowanej: 10-15



Peptydy i ich otrzymywanie
Synteza peptydówPeptydy od ponad stu lat są obiektem zainteresowań naukowców. Pierwsze substancje otrzymane na początku XX wieku długo czekały na wdrożenie do lecznictwa co nastąpiło dopiero po sukcesie otrzymania insuliny. Obecnie leki peptydowe stanowią ważną grupę substancji stosowaną w szeregu chorób. Na czoło wysuwają się hormony oraz przeciwciała. W szczególności farmakologiczna właściwość peptydów ich działania z receptorami komórkowymi (PPIs - protein-protein interactions).

Krokiem milowym w historii peptydów było opracowanie przez Merrifielda syntezy na nośniku stałym. Polega ona na przyłączeniu pierwszego pierwszego aminokwasu do nierozpuszczalnego polimeru i stopniowym przyłączaniu kolejnych segmentów budowanego związku. Schemat postępowania w trakcie syntezy na nośniku stałym przedstawia rysunek 1.


Rys. 1. Schemat postępowania podczas syntezy peptydów na nośniku stałym


Możliwość automatyzacji procesu syntezy peptydów została wykorzystana już w połowie lat sześćdziesiątych wraz ze zbudowaniem pierwszych automatycznych syntezatorów. Jednak to nie sam proces syntezy pochłaniał najwięcej czasu ale mozolne oczyszczanie produktów reakcji. Do lat 90-tych, kiedy powszechna stała się metoda syntezy z wykorzystaniem do ochrony grupy α-aminowej aminokwasów ugrupowania 9-fluorenylometoksykarboksylowego (Fmoc) czas samej syntezy był porównywalny do czasu oczyszczania tych związków. Postęp w zastosowaniu syntezy na nośniku stałym oraz opracowanie wydajnej syntezy Fmoc spowodowało, że oczyszczanie z użyciem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) produktów reakcji można było skrócić często do kilkudziesięciu minut. Produkty reakcji po syntezie Fmoc stały się dużo czystsze niż produkty otrzymywanie chemią Boc, która przez kilkadziesiąt lat dominowała w pracach chemików peptydowych.

Automatyczne syntezatory peptydów
Jeszcze dwie dekady temu otrzymanie peptydów w ilości 20-30 sztuk oznaczało olbrzymi wkład pracy a sama synteza oraz charakterystyka produktów stanowiły niejednokrotnie podstawę rozprawy doktorskiej. Zwykle badania biologiczne wykonywane były już we współpracy naukowej. Olbrzymi rozwój nowoczesnych syntezatorów i ich łatwiejsza dostępność spowodowała, że na przełomie ostatnich lat sama synteza nie stanowi już „wiedzy tajemnej” a wykonujący ją chemicy mogą więcej czasu poświęcić na projektowanie badań czy szukania nowych zastosowań dla tych substancji. W naszym laboratorium wielokrotne prowadziliśmy szkolenia dotyczące syntezy peptydów, które udowodniły że podstawy otrzymywania tych substancji można opanować w ciągu kilkunastu, a nawet kilku dni.

Oprócz możliwości szybkiej syntezy, urządzenia automatyczne mają szereg innych zalet. Mogą pracować nieprzerwanie bez dozoru, badać stopień acylowania lub kompletność deprotekcji grup ochronnych. Nie wymagają kontaktu operatora z toksycznymi odczynnikami (poza etapem przygotowania odczynników do urządzenia).

Ewolucja związana z procesem otrzymywania peptydów na przełomie ostatnich kilkudziesięciu lat przedstawiona została na rys. 2.


Rys.2. Ewolucja związana z procesem otrzymywania peptydów


Idea promieniowania mikrofalowego
Pierwotnie promieniowanie mikrofalowe wykorzystywane było jako zamiennik płaszczy grzejnych do przyśpieszania reakcji chemicznych, natomiast jako pierwsze reaktory posłużyły domowe kuchenki mikrofalowe. Pole elektromagnetyczne oddziałując z cząsteczkami posiadającymi moment dipolowy, powoduje ich reorientację nadając im energię kinetyczną. Zderzające się następnie ze sobą cząsteczki powodują zamianę tej energii na ciepło. Pomimo niskiej sprawności magnetronów, przemieniającej energię elektryczną w mikrofalową, ten rodzaj ogrzewania zyskał przychylność dzięki równomiernemu ogrzewaniu mieszaniny reakcyjnej w całej objętości naczynia już od pierwszych chwil syntezy. Możliwe stało się także umieszczanie i ogrzewanie naczyń o niestandardowych kształtach, o ile tylko wykonane były z materiałów transparentnych dla mikrofal, takich jak szkło czy PTFE. Niewielka modyfikacja częstotliwości pracy magnetronu przyniosła dodatkowe korzyści. W niektórych reakcjach chemicznych zaobserwowano inny mechanizm prowadzący do zwiększenia wydajności lub otrzymania zupełnie innego produktu, który wcześniej był trudny do otrzymania. Możliwe stało się także ogrzewanie rozpuszczalników nieco powyżej temperatury wrzenia. Obecnie uważa się, że nie wszystkie korzyści płynące z tego rodzaju ogrzewania zostały poznane.

Synteza mikrofalowa peptydów
Peptydy po raz pierwszy zostały otrzymane z użyciem mikrofal w roku 1992. Jednak dopiero po dziesięciu kolejnych latach opracowano w firmie CEM urządzenia łączące w sobie klasyczne syntezatory (zwykle system zaworów, rezerwuary, naczynie reakcyjne) z reaktorem mikrofalowym. Wiele grup naukowców przez lata podważało skuteczność syntezy mikrofalowej w kontekście potencjalnych problemów z racemizacją. Badania kilku zespołów udowodniły, że stopień racemizacji będącej wynikiem syntezy mikrofalowej nie odbiega od wartości uzyskanych dla syntezy klasycznej. Co więcej, samo tylko równomierne rozprowadzenie ciepła, jako jeden z efektów promieniowania mikrofalowego, nie tylko przyspiesza reakcję w sposób jednolity, ale pomaga też lepiej penetrować ziarna nośnika (polimeru) podczas etapów przemywania. Ostatnie badania dowiodły, że do wydajnego przemycia polimeru wystarczają zaledwie trzy porcje dimetyloformamidu (w klasycznej syntezie używa się minimum sześciu porcji przemywających nośnik rozpuszczalników).

Użycie promieniowania mikrofalowego szczególnie widoczne jest w przypadku peptydów posiadających tendencję do agregacji. Tzw. trudne sekwencje oraz syntezy obarczone procesami agregacji łańcucha peptydowego stały się obecnie łatwiejsze do przeprowadzenia. Korzystny efekt jako skutek zastosowania promieniowania mikrofalowego podczas syntezy peptydów metodą na nośniku stałym o dłuższych sekwencjach przedstawia rysunek 3.


Rys. 3. Wpływ promieniowania mikrofalowego na zachowanie łańcucha peptydowego


Otrzymywanie peptydów to nie tylko synteza
Otrzymywanie peptydów jest procesem wieloetapowym. Projektowanie syntezy, dobór odczynników i odpowiedniego naczynia reakcyjnego często ważą na wydajnościach reakcji. W przypadku automatycznych syntezatorów producent zwykle dostarcza użytkownikowi stosowną wiedzą. Bardzo ważnym etapem w otrzymywaniu gotowego peptydu nadal pozostaje jego oczyszczanie i analiza, zarówno pod kątem czystości jak i tożsamości. Zbyt duża polarność peptydu, duża zawartość reszt aminokwasów hydrofobowych czy duże zanieczyszczenie produktami powstałymi podczas odszczepiania peptydów od nośnika, problemy z suszeniem sublimacyjnym, powodują że sam syntezator to nie wszystko. Do skutecznej pracy nadal potrzebna jest wiedza i doświadczenie chemika. Szczególnie biorąc pod uwagę związki syntezowane w celu badań nad ich aktywnością farmakologiczną czy użyciem w preparatach kosmetycznych. Próba przewidywania procesów mogących zachodzić na każdym etapie syntezy, a co za tym idzie jego optymalizacja stanowi obecnie zainteresowanie każdej jednostki, zarówno naukowej jak i przemysłu zajmującego się związkami peptydowymi.


Tabela 1. Porównanie czasu trwania pełnego cyklu przyłączania jednej reszty aminokwasowej metodą Fmoc/tBu (warunki stosowane w Laboratorium Syntezy Peptydów firmy Lipopharm.pl)