Istotnymi problemami występującym podczas syntezy peptydów na nośniku stałym (SPPS, ang. Solid Phase Peptide Synthesis) są agregacja łańcuchów peptydowych oraz słaba ich solwatacja prowadzące do niekompletnej deprotekcji i/lub acylowania. Rezultatem tego jest niski stopień czystości produktów syntezy. [1] Występowanie tego zjawiska nasila się w przypadku długich sekwencji aminokwasów oraz peptydów zawierających wiele reszt hydrofobowych, dla których w wyniku wspomnianej agregacji, wydajności dla etapów deprotekcji oraz kondensacji ulegają drastycznemu obniżeniu. Późniejsze oczyszczanie surowej mieszaniny peptydów staje się zadaniem złożonym i czasochłonnym, często wymagającym kilkukrotnego zastosowania technik chromatograficznych, co prowadzi do redukcji wydajności dla pożądanego peptydu. [2]

Zastosowanie promieniowania mikrofalowego podczas syntezy peptydów przyczyniło się do obniżenia stopnia agregacji, zwiększenia czystości produktu, oraz skrócenia czasu syntezy. [3] Ostatnimi czasy, ulepszono sposób aplikacji mikrofal oraz zwielokrotniono korzyści płynące z takowego wspomagania, opracowując metodę wysokowydajnej syntezy peptydów na nośniku stałym (HE-SPPS, ang. High Efficiency SPPS). Udoskonalenie pod postacią HE-SPPS, dotyczy aspektu chemicznego oraz aparatury, czego efektem jest zniwelowanie problemu powstających produktów ubocznych, przy jednoczesnej redukcji czasu trwania cyklu syntezy do 4 minut, a także o 90% niższej produkcji odpadów poreakcyjnych. [4] Syntezator peptydów Liberty Blue™, został zaprojektowany by zautomatyzować metodę HE-SPPS, co w efekcie pozwala na zsyntezowanie peptydu złożonego z piętnastu aminokwasów w przeciągu godziny przy zachowaniu wysokiej czystości produktu oraz minimalnym zużyciu rozpuszczalników.

Dobrze znany jest wpływ właściwości żywicy na jakość peptydu otrzymywanego za pomocą SPPS. Z tego powodu poszukiwaliśmy udoskonalonej żywicy opierając się na poprawie efektu końcowego syntezy realizowanej za pomocą automatycznego mikrofalowego syntezatora peptydów Liberty Blue™ przy zastosowaniu metody HE-SPPS. W naszym badaniu skupiliśmy się na żywicach SpheriTide®, które są wyjątkowe w porównaniu do tradycyjnych żywic na bazie polistyrenu i PEG. Składają się one z poli-ε-lizyny niecałkowicie usieciowanej homobifunkcyjnymi kwasami karboksylowymi, co zapewnia występowanie w środowisku reakcji wiązań amidowych podobnych do tych obecnych w łańcuchu peptydowym. W rezultacie otrzymano hydrofilowy, peptydopodobny szkielet, który umożliwia obniżenie tendencji do tworzenia się wewnątrzcząsteczkowych agregatów. Dodatkowo wydłużane łańcuchy peptydowe są związane z grupami α-aminowymi, które ze względu na wysoce wyspecjalizowany charakter żywicy SpheriTide® są rozmieszczone w minimalnej odległości od siebie. Pozwala to na uniknięcie tworzenia się klastrów pomiędzy linkerami, umożliwiając syntezę prowadzącą do produktu o wysokim stopniu czystości nawet przy osadzeniu żywicy większym niż 1 mmol/g.

Końcowym etapem podczas otrzymywania wysokiej czystości peptydu jest jego odszczepienie od nośnika. Zastosowanie rozwiązania oferowanego przez Accent™ Peptide Cleavage System, umożliwia odszczepienie peptydu w skali mikro by kontrolować postęp podczas skomplikowanej syntezy, a także w pełnej skali po jej zakończeniu. W przeciwieństwie do techniki tradycyjnej, dzięki urządzeniu Accent™ można dokonać “mikroodszczepienia” w przeciągu zaledwie 2 minut, zaś w przypadku skali makro czas ten nie przekracza 30 minut.

W celu przetestowania żywicy SpheriTide® i dokładniejszego zbadania metody HE-SPPS przy wykorzystaniu syntezatora Liberty BlueTM, wyselekcjonowano do syntezy dwa peptydy. EGFRvIII i 1-42β-amyloid zostały wybrane ze względu na ich złożoną syntezę, która nastręcza licznych problemów. Peptydy zostały początkowo zsyntezowane na żywicy bazującej na polistyrenie, a następnie na żywicy Rink amide SpheriTide® zarówno o niskim jak i wysokim stopniu osadzenia.

EGFRvIII (LEEKKGNYVVTDHC) został zsyntezowany w celu porównania HE-SPPS z syntezą na nośniku stałym w temperaturze pokojowej. Synteza prowadzona w standardowej temperaturze pokojowej na żywicy Rink amide MBHA PS o niskim stopniu osadzenia (osadzenie 0,38 mmol/g) dała w rezultacie śladowe ilości produktu. Jest to zgodne z uprzednio opublikowanymi wynikami badań, gdzie każdorazowo po etapie sprzęgania wymagana była kilkukrotna deprotekcja (w niektórych przypadkach do ośmiu powtórzeń), zaś czas sprzęgania przekraczał 12 godzin, co w efekcie doprowadziło do uzyskania surowych produktów, których czystość wynosiła od 40 do 70%. [5] Wykorzystanie tej samej żywicy w warunkach HE-SPPS umożliwiło otrzymanie produktu o czystości 72% w nieco ponad godzinę.

Żywica Rink amide SpheriTide® o wyższym stopniu osadzenia (osadzenie 1,05 mmol/g) okazała się najkorzystniejsza, umożliwiła osiągnięcie tych samych rezultatów co uprzednio opisana, a to wskazuje, że unikalne właściwości tej żywicy pozwalają jej konkurować z żywicami słabiej osadzonymi w przypadku pewnych problematycznych sekwencji aminokwasowych. Wysoką czystość surowego produktu otrzymanego na żywicy o znacznym stopniu osadzenia można przypisać (1) hydrofilowemu charakterowi żywicy, co zapobiega agregacji wewnątrz łańcucha syntezowanego peptydu oraz (2) równomiernemu rozmieszczeniu miejsc inicjacji reakcji kondensacji.

W celu wykazania uniwersalności metody HE-SPPS oraz żywicy SpheriTide®, zsyntezowano szczególnie kłopotliwą i złożoną sekwencję 1-42β-amyloidu (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA). 1-42β-amyloid jest uważany za wyzwanie zarówno w kontekście syntezy chemicznej jak i analizy. Stosując żywicę Rink amide SpheriTide® (LL) (osadzenie 0,17 mmol/g) otrzymano produkt o czystości 65%, co określono za pomocą UPLC-MS.

Żywica SpheriTide® w połączeniu z techniką HE-SPPS oraz syntezatorem Liberty Blue™ pozwala na otrzymanie wysokiej czystości peptydów w krótkim czasie. Po zakończeniu syntezy peptyd może być z łatwością oraz wysoką wydajnością odszczepiony od żywicy przy użyciu systemu Accent™. Nawet trudne sekwencje aminokwasów mogą być otrzymane efektywnie oraz z zadowalającą czystością surowego produktu.

Literatura:

 

1. Rovero, P. In Solid Phase Synthesis. A Practical Guide; Kates, S. A.; Albericio, F., Eds.; Marcel Dekker: New York, 2000; Chapters 1-6.

 

2. Quibell, M.; Johnson, T. In Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach; W. C. Chan, P. D. White, (Eds.); Oxford University Press: New York, 2000; Chapters 1-2.

 

3. References include: (a)Yu, H. M.; Chen, S. T.; Wang, K. T.; J. Org. Chem., 1992, 57, 4781. (b) Erdélyi, M.; Gogoll, A.; Synthesis, 2002, 11, 1592. (c) Vanier, G. S. In Microwave Heating as a Tool for Sustainable Chemistry; Leadbeater, N. E., Ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, 2010; Chapter 9, p 231. (d) Palasek, S. A.; Cox, Z. J.; Collins, J. M.; J. Pept. Sci., 2007, 13, 143. (e) Collins, J. M. Microwaves in Organic Synthesis, 3rd ed.; Hoz, A., Loupy, A., Eds.; Wiley-VCH: Weinheim, Germany, 2013; Vol. 2, Chapter 20, p 897.

 

4. Collins, J.M.; Porter, K.A.; Singh, S.K.; Vanier, G.S.; Org. Lett., 2014, 16, 940.

 

5. Finneman, J.I.; Pozzo, M. J.; J. Pep. Sci. 2012, 8, 511.