Jack E. Silver
Teledyne Jsco
strony wersji drukowanej: 44-45


Synteza i oczyszczanie peptydów jest procesem trudnym i długotrwałym. Peptydy są wykorzystywane w badaniach nad nowymi lekami, a ich wykorzystanie rośnie też jako aktywnych substancji farmaceutycznych (API, ang. Active Pharmaceutical Ingredient). To zwiększone wykorzystanie peptydów wymaga lepszych technik Synteza peptydówoczyszczania. Zanieczyszczenia w syntezowanych peptydach mogą pochodzić z wielu źródeł. Są nimi m.in. niekompletnie przeprowadzone poszczególne etapy syntezy, takie jak częściowa deprotekcja grupy ochronnej N-końcowego aminokwasu, czy niezupełna kondensacja kolejnych aminokwasów podczas wydłużania łańcucha. Ponadto, istotnym aspektem jest czystość optyczna końcowego produktu – podczas prowadzonych reakcji może dojść do racemizacji poszczególnych aminokwasów. Dlatego też należy stosować odpowiednie odczynniki przeciwracemizacyjne jak HOBt, HOAt, czy Oxyma. Liczne reakcje uboczne także wpływają na czystość surowego peptydu. Problemem jest chociażby tworzenie się aspartamidu, czy cyklizacja N-końcowej glutaminy. Kluczowym etapem, który źle przeprowadzony może doprowadzić do całkowitej degradacji właściwego peptydu jest etap odszczepiania go od żywicy. Należy uwzględnić takie parametry jak skład stosowanej mieszaniny, czas, czy temperatura procesu. Zbyt długie lub krótkie odszczepianie, jak i niewłaściwa temperatura mogą istotnie przyczynić się do niepowodzenia. Skład mieszaniny podyktowany jest zawartymi w sekwencji peptydowej aminokwasami oraz grupami ochronnymi obecnymi w ich łańcuchach bocznych. Niezastosowanie odpowiednich zmiataczy grup ochronnych spowoduje, że pozostaną one na swoim miejscu bądź, jako reaktywne molekuły przyłączą się do innego ugrupowania w łańcuchu, np. grupa tritylowa, czy też Pbf.

Jeżeli w sekwencji peptydowej występuje cysteina, bądź metionina należy także uwzględnić ryzyko ich utlenienia, by zapobiec konieczności ich późniejszej redukcji, która nie zawsze kończy się sukcesem. Jest to tylko część z problemów występujących podczas pracy ze związkami peptydowymi, w wyniku, których ich otrzymywanie często bywa złożone.

Wiele laboratoriów badawczych zakupuje gotowe peptydy od laboratoriów specjalizujących się w syntezie tego typu związków. Powoduje to zaoszczędzenia miejsca, które byłoby wymagane do umiejscowienia niezbędnej aparatury. Laboratoria syntetyczne oferują także oczyszczanie zsyntezowanych peptydów za dodatkową opłatą przy wydłużeniu czasu realizacji zamówienia.

Układ chromatograficzny CombiFlash® EZ Prep wraz ze spektrometrem masowym PurIon Model L (P/N 68-5230-025 oraz 68-5237-084) i kolumną RediSep® Prep pozwala by w laboratorium badawczym zostały zaoszczędzone pieniądze oraz czas poprzez samodzielne oczyszczanie otrzymanych przez podmioty zewnętrzne peptydów.


Rycina 1: EZ Prep System wraz ze spektrometrem masowym oraz kolumnami RediSep.


Peptyd o sekwencji HNWYPAAPH przebadano jako inhibitor ACE1, a zsyntezowany i oczyszczony został przez współpracujące laboratorium specjalizujące się w syntezie i oczyszczaniu peptydów, zaś czas dostawy i cena przedstawione są w tabeli 1 zamieszczonej poniżej2.


Tabela 1: Czas i koszt syntezy oraz oczyszczania 1000mg HNWYPAAPH.



Surowy peptyd został zakupiony. Zestaw CombiFlash EZ Prep wykorzystano w celu weryfikacji tożsamości otrzymanego peptydu, a także by potwierdzić adekwatność wyjściowych parametrów jonizacji (domyślnych) względem badanego związku (Rycina 2).


Rycina 2: Weryfikacja tożsamości peptydu HNWYPAAPH.


Wyznaczona masa odpowiada wartości oczekiwanej (masa monoizotopowa to 1091,5 Da). Widoczne sygnały pochodzą od jonów [M+H]+ (1092 Da); [M+Na]+ (1114 Da); oraz od dwukrotnie naładowanego [M+2H]2+ (546 Da). Piki 546 oraz 1092 Da zostały określone w oknie metody (Rycina 2) jako jony umożliwiające detekcję peptydu, w związku z czym automatycznie został one przeniesione do stosowanej metody rozdzielania (Rycina 3).
Rycina 3: Oczyszczanie HNWYPAAPH za pomocą EZ Prep.


W przypadku oczyszczanej próbki, główny pik obserwujemy od 16,3 do 17,6 minuty, zaś masa produktu dla tego zakresu wynosi 7,8 mg (wydajność 76,4%) o czystości powyżej 99%.
Zastosowanie CombiFlash EZ Prep wraz ze spektrometrem mas PurIon Model L pozwoliło na otrzymanie pożądanego produktu o trzy tygodnie wcześniej niż miałoby to miejsce w przypadku powierzenia całości zlecenia specjalistycznemu laboratorium. Dodatkowo należy uwzględnić zaoszczędzone $800 USD. Oczyszczając peptydy jedynie, gdy to konieczne, zapewniamy nieprzerwaną dostępność świeżo oczyszczonego peptydu, co jest korzystne ze względu na możliwość jego degradacji podczas dłuższego przechowywania. Ograniczenie się do niezbędnego oczyszczania, skutkuje dostarczaniem jedynie czystego materiału do badań, a jednocześnie wyeliminowana zostaje możliwość wpływu degradacji peptydu na wynik prowadzonych eksperymentów.


Kontakt:
Selwa Sp. z o.o.
ul. Okopowa 56 lok. 243, 01-042 Warszawa,
tel. +48 22 29 25 106-7
Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript. www.selwa-lab.pl


Literatura:

1. Lee,S-J; Kim, Y-S; Kim, S-E; Kim, E-K; Hwang, J-W; Park, T-K; Kim, B.K; Moon, S-H; Jeon, B-T; Jeon, Y-J; Ahn, C-B; Je, J-Y, Park, P-J. Purification and Characterization of a Novel Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptide Derived from an Enzymatic Hydrolysate of Duck Skin Byproducts. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 10035-10040.

2. Quoted 26 May 2015.