Katarzyna Woś, Alicja Zabielska, Teresa Baster
Grupa Adamed, Pion Generyczny R&D

Nowe, wprowadzane do obrotu produkty lecznicze muszą charakteryzować się identyczną skutecznością terapeutyczną oraz bezpieczeństwem porównywalnym z lekami referencyjnymi. Zapewnienie powtarzalnej jakości dla produktów leczniczych czy też suplementów diety dostępnych na rynku wiąże się ze znaczącymi nakładami finansowymi na kontrolę każdej serii produktu. W rozwoju produktów leczniczych znaczący koszt stanowi udowodnienie identycznej dostępności farmaceutycznej nowego produktu względem produktu referencyjnego. Badania dostępności farmaceutycznej stałych form leków w warunkach laboratoryjnych - „in vitro” wykonuje się w specjalnych aparatach do tego celu przeznaczonych oznaczając ilość substancji aktywnej rozpuszczonej (uwolnionej) w medium o określonym pH, w określonych punktach czasowych prowadzonego testu. Wybór metody oznaczania ilości uwolnionej substancji czynnej uzależniony jest od właściwości substancji czynnej, składników placebo produktu leczniczego oraz dostępnej aparatury. Najczęściej zalecane przez farmakopee, jak również wykorzystywane techniki pomiarowe to spektrofotometria UV-Vis oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa. Istnieje jednak grupa produktów farmaceutycznych, dla których do oznaczania zawartości lub ilości uwolnionej substancji czynnej monografia farmakopealna zaleca stosowanie metody miareczkowej. Przykładem takich substancji są sole wapnia, magnezu, potasu i litu. Proponowana przez Farmakopee metodyka nie daje szansy na automatyzację i bardziej wydajne wykorzystanie czasu analityka. W niniejszym artykule przedstawiamy alternatywną metodę chromatografii jonowej z detekcją konduktometryczną umożliwiającą oznaczenie ilościowe soli zawierających kationy: litu, sodu, amonu, potasu, magnezu i wapnia. Szczegółowy opis metody przedstawiono dla oznaczania chlorku potasu w różnych produktach leczniczych wraz z ocenę jego dostępności farmaceutycznej na podstawie eksperymentalnie wyznaczonych profili uwalniania.

Chromatografia jonowa z detekcją konduktometryczną jest techniką analityczną szeroko wykorzystywaną w różnych gałęziach przemysłu. Wykorzystywana jest przede wszystkim w oczyszczaniu ścieków, uzdatnianiu wody i ochronie środowiska [1-3]. Znalazła również zastosowanie w kryminalistyce [4] i farmacji [5-8]. W przemyśle farmaceutycznym jest jednak techniką niedocenianą. Pomimo iż, umożliwia oznaczanie ilościowe popularnych substancji używanych do wyrobu produktów leczniczych i suplementów diety, takich jak sole magnezu, wapnia, potasu i litu, jest przez Farmakopee pomijana. Przykładowo dla chlorku potasu, substancji czynnej produktów gotowych np. tabletek, do oznaczania ilości uwolnionej substancji czynnej Farmakopea Brytyjska publikuje metodę miareczkowania strąceniowego -argentometrię polegającą na oznaczaniu przeciwjonu – anionu chlorkowego. Zalety tej klasycznej metody to przede wszystkim jej dostępność i relatywnie niskie koszty analiz. Wady to niewątpliwie duża pracochłonność, brak możliwości pełnej automatyzacji, a ze strony typowo analitycznej to często brak wymaganej selektywności oraz wpływ substancji pomocniczych (matrycy produktu leczniczego) na dokładność i precyzję metody. Należy podkreślić fakt, iż produkty lecznicze są często złożonymi, wieloskładnikowymi wyrobami występującymi w różnych postaciach. Oznaczenie powszechnie występujących kationów, między innymi kationów potasu czy sodu metodami, które są wrażliwe na czynniki takie jak zabarwienie roztworu badanego czy obecność w roztworach badanych innych jonów może nastręczać wiele trudności [9]. Do takich technik należą między innymi wymienione metody miareczkowe i popularnie stosowana fotometria płomieniowa.

Badanie uwalniania substancji czynnej w produkcie gotowym przeprowadzane jest w oparciu o wytyczne ICH oraz zalecenia spisane w Farmakopeach. Wykonywane jest w specjalnym aparacie do badania uwalniania i polega na umieszczeniu produktu gotowego np. tabletki w odpowiedniej ilości płynu akceptorowego (zazwyczaj objętości 900 ml) znajdującego się w zlewce w termostatowanej łaźni (37°C), a następnie określaniu stężenia uwolnionej substancji czynnej w określonych odstępach czasu. W pobieranym płynie oznacza się zawartość rozpuszczonej substancji leczniczej. W oparciu o otrzymane wyniki, wyznacza się zależność obrazującą szybkość uwalniania (tak zwany profil uwalniana substancji czynnej), czyli dostępność farmaceutyczną produktu.

Na eksperymenty prowadzące do wyznaczenia profilu uwalniania składają się wielkokrotne oznaczenia związane z dużą ilością punktów poborów próbek z sześciu lub dwunastu jednostek leku. Koniecznością jest stosowanie metod analitycznych umożliwiających automatyzację i tym samym lepsze wykorzystanie czasu analityka. Zastosowanie zautomatyzowanych metod chromatograficznych zamiast metod, których automatyzacja jest mocno ograniczona (na przykład metody miareczkowe) zdecydowanie zmniejsza pracochłonność całego procesu.

Aby przybliżyć warunki panujące w poszczególnych częściach układu pokarmowego człowieka, jako płyny akceptorowe stosuje się roztwory wodne kwasów i soli nieorganicznych o zbliżonym pH do fizjologicznego. Popularnym płynem akceptorowym jest 0,1 M roztwór kwasu solnego symulujący warunki panujące w żołądku. Użycie tego płynu wyklucza oznaczenie kationów potasu przy zastosowaniu wcześniej wspomnianej, pośredniej metody argentometrycznej.

W związku z powyższymi faktami, jako alternatywę, przedstawiono metodę chromatografii jonowej z tłumieniem przewodności i detektorem konduktometrycznym do oznaczania jonów potasu przy ocenie dostępności farmakologicznej produktu na podstawie jej profilu uwalniania w wodzie.

Preparaty z chlorkiem potasu stosuje się w profilaktyce i leczeniu stanów niedoboru potasu w organizmie, dlatego krytycznym aspektem jest pewność, że pacjent otrzymuje optymalną formę farmaceutyczną.

Wybrane do badania produkty zawierające chlorek potasu należą do grupy preparatów o przedłużonym uwalnianiu. Substancja lecznicza uwalnia się w całej długości przewodu pokarmowego, ale bardzo powoli. Zadaniem tego typu produktów jest zapewnianie stałego stężenia substancji leczniczej w ciągu 8 – 12 godzin, a czasem nawet 24 godzin, bez konieczności wielokrotnego podawania.

Znane są przypadki ostrych zatruć chlorkiem potasu związanych z podaniem pacjentom formy leku charakteryzującej się zbyt szybkim uwolnieniem substancji czynnej [10-12].

Wymagania w stosunku do ilości uwolnionego chlorku potasu w czasie podaje Farmakopea Brytyjska, monografia “Prolonged-release Potassium Chloride Tablets”:
  • po 1 godzinie nie więcej niż 50 %,
  • po 2 godzinie nie mniej niż 25 % i nie więcej niż 75 %,
  • po 6 godzinie nie mniej niż 75 %, w przeliczeniu na deklarowaną zawartość chlorku potasu.

Opracowana metoda analityczna pozwala w sposób selektywny oznaczyć ilość uwolnionego jonu potasu (chlorku potasu) za pomocą chromatografii jonowej.

Profile uwalniania dla wybranych preparatów farmaceutycznych zawierających chlorek potasu zostały wykonane w aparacie do badania uwalniania typ 2 według Farmakopei Europejskiej. Pojedyncze dawki preparatów zostały umieszczone w niewielkich, stalowych koszyczkach służących do utrzymania ich na dnie zlewki. Płyn akceptorowy, – woda, objętość 900 ml. Obroty łopatek: 50 obrotów/minutę. Temperatura łaźni: 37 ± 0,5°C. Czas poboru prób: 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360 minuta lub mniej w przypadku przedwczesnego uwolnienia się substancji.

Zastosowano chromatograf jonowy wyposażony w układ termostatowania kolumny, detektor konduktometryczny, automatyczny podajnik prób oraz tłumik jonów CSRS 4 mm. Kolumna HPLC: Dionex CS 17 250 mm × 4,0 mm. Temperatura komuny: 30°C. Faza ruchoma: 6 mM kwas metanosulfonowy w wodzie. Przepływ fazy ruchomej: 1 ml/min. Czas analizy: 5 min.

Profil uwalniania chlorku potasu wyznaczono w oparciu o sporządzoną krzywą kalibracyjną w zakresie stosowalności od 0,20 do 1,10 mg/ml. Wartość współczynnika korelacji krzywej kalibracyjnej wynosiła R ≥ 0,99.

Analizę profili uwalniania przeprowadzono dla 12 jednostek następujących preparatów farmaceutycznych:
  • Potazek, kapsułki o przedłużonym uwalnianiu, seria 108,
  • Kaldyum®, kapsułki o przedłużonym uwalnianiu, seria D823N0312,
  • Katelin, kapsułki o zmodyfikowanym uwalnianiu, seria 130501,
  • Kalipoz® prolongatum, tabletki o przedłużonym uwalnianiu, seria UH1143.

Wnioski
Średnie procentowe ilości uwolnionego chlorku potasu dla poszczególnych preparatów farmaceutycznych przedstawiono w formie liczbowej (Tabela 1) oraz graficznej (Rys.1).


Tabela 1. Profile uwalniania potasu w badanych preparatach farmaceutycznych.





Rys. 1. Profile uwalniania przeanalizowanych preparatów z chlorkiem potasu.

Przykładowe chromatogramy uzyskane w trakcie analizy preparatów zawierających chlorek potasu na chromatografie jonowym zaprezentowano poniżej (Rys. 2-3).


Rys. 2 Przykładowy chromatogram wodnego roztworu chlorku potasu o stężeniu około 1,1 mg/ml.


Rys. 3 Przykładowy chromatogram roztworu próby badanej preparatu zawierającego, jako substancję czynną chlorek potasu.

Profile uwalniania preparatów Potazek kapsułki o przedłużonym uwalnianiu i Kaldyum® kapsułki o przedłużonym uwalnianiu spełniają wymagania monografii Farmakopei Brytyjskiej dla “Prolonged-release Potassium Chloride Tablets”. Uzyskane wyniki potwierdzają, że w/w preparaty farmaceutyczne posiadają profile uwalniania właściwe produktom o przedłużonym uwalnianiu. Natomiast profil uwalniania preparatu Kalipoz® prolongatum tabletki o przedłużonym uwalnianiu spełnia wymagania monografii Farmakopei Brytyjskiej dla “Prolonged-release Potassium Chloride Tablets” w dwóch punktach czasowych.

Podsumowanie

Zaprezentowana metoda oznaczania potasu posiada szeroki wachlarz zastosowania w przemyśle farmaceutycznym, i nie tylko. Niewątpliwie zaletami powyższej metody są: selektywność, prosty sposób przygotowania i niewielka ilość roztworu potrzebna do oznaczenia oraz oszczędność czasu płynąca z możliwości pełnej automatyzacji procesu.

Dodatkowo, zaletą chromatografii jonowej jest współoznaczanie wybranych jonów w czasie nieprzekraczającym kilkunastu minut oraz możliwość uzyskania pełnej informacji na temat składu jonowego próbki (aniony i kationy) z zastosowaniem tylko jednej techniki analitycznej. Opisana metoda analityczna po wydłużeniu czasu analizy z 5 do około 13 minut umożliwia oznaczenie kationów dwuwartościowych, takich jak kation magnezu czy wapnia. Sole zawierające te jony są popularnymi składnikami suplementów diety. Przykładowe chromatogramy uzyskane w trakcie analizy zawartości kationu magnezowego w popularnym suplemencie diety przedstawiono poniżej (Rys. 4 - 6)


Rys. 4 Przykładowy chromatogram uzyskany w wyniki analizy wodnego roztworu soli zawierających kationy: litowy, sodowy, amonowy, potasowy, magnezowy i wapniowy.


Rys. 5 Przykładowy chromatogram wodnego roztworu zawierającego kationy magnezu o stężeniu około 45 µg/ml.


Rys. 6 Przykładowy chromatogram próby badanej suplementu diety zawierającego związki magnezu, jako składnik aktywny.


Literatura

  1. A.J. Currana , A. S. Palmer J. Chromatogr. A 919 (2001) 107–113.
  2. H. Thomas, M. Rey, P.E. Jackson, J. Chromatogr. A 956 (2002) 181–186.
  3. J. B. A. Karim, J.-Y. Jin, T. Takeuchi, J. Chromatogr. A 995 (2003) 153–160.
  4. -B. Meng, T.-R. Wang, B.-Y. Guob, Y. Hashi, C.-X. Guoa, J.-M. Lin, Talanta 76 (2008) 241–245.
  5. Vinkovi´c, V. Drevenkar, J. Chromatogr. B 864 (2008) 102–108.
  6. Pharmaceutical Sciences Encyclopedia: Drug Discovery, Development, and Manufacturing, 2010 John Wiley & Sons, Inc.
  7. K. Jagota, A. J. Chetram, J. B. Nair J. Chromatogr. A 739 (1996) 343-349.
  8. Krol, P. G. Alden, J. Morawski, P. E. Jackson, J. Chromatogr. A 626 (1992) 165‑170.
  9. -J. Chen, Y.-T. Hsieh, Y.-M. Weng, R. Y.-Y. Chiou Food Chem. 91 (2005) 765‑770.
  10. Su, C. Stork, S. Ravuri, T. Lavoie, D. Anguish, L.S. Nelson, R.S. Hoffman, J.Toxicol. Clin. Toxicol. 39 (2001) 641-648.
  11. J. Steedman, Arch. Emerg. Med. 5 (1988) 206–211.
  12. B. Whitehouse Br. Med. J. 1980; 281(6240): 618.