Znajdź nas na:

Walidacja metod analitycznych w farmacji

Walidacja metod analitycznych w farmacji

Przemysł farmaceutyczny to specyficzna gałąź przemysłu ze względu na rodzaj dostarczanych produktów. Leki od których zależy zdrowie, a niekiedy i życie ludzi muszą być wyprodukowane i skontrolowane w sposób nie budzący zastrzeżeń, zgodnie z najwyższymi standardami jakości i osiągnięciami naukowymi. Podstawą badań kontroli jakości są właściwie opracowane i scharakteryzowane metody badawcze.

Maria Kurszewska

Laboratorium Badawczo - Rozwojowe, Lipopharm.pl

 

Przemysł farmaceutyczny to specyficzna gałąź przemysłu ze względu na rodzaj dostarczanych produktów. Leki od których zależy zdrowie, a niekiedy i życie ludzi muszą być wyprodukowane i skontrolowane w sposób nie budzący zastrzeżeń, zgodnie z najwyższymi standardami jakości i osiągnięciami naukowymi. Podstawą badań kontroli jakości są właściwie opracowane i scharakteryzowane metody badawcze.

 

Metoda obejmuje wszystkie czynności związane z wykonaniem analizy, począwszy od przygotowania badanej próbki, poprzez  pomiar wielkości mierzonej, będącej podstawą oznaczenia, a skończywszy na opracowaniu wyników (Schemat 1).

 

Schemat 1

 

Pod pojęciem walidacji  metody rozumie się udokumentowany program dający wysoki stopień pewności, że określona metoda będzie w sposób powtarzalny prowadzić do otrzymania wyników spełniających określone kryteria akceptacji.

 

Obowiązek walidacji metod analitycznych narzuca na producentów substancji aktywnych i/lub produktów leczniczych Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania.1 Walidacja jest także wymagana przez urzędy państwowe w ramach rejestracji leków.

 

Szczegółowe wymagania dotyczące walidacji metod analitycznych regulują wytyczne ICH2 (ang.  The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use):  ICH Q2(R1)   „Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology”

 

PARAMETRY WALIDACYJNE

Walidacji wymagają 3 rodzaje metod analitycznych:

 

identyfikacji (sprawdzenia tożsamości) substancji

- potwierdzają tożsamość danej substancji w analizowanej próbce poprzez porównanie określonego parametru (np. czasu retencji, położenia pasma absorpcyjnego) próbki badanej z tym samym parametrem substancji wzorcowej/porównawczej.

 

badania czystości

- umożliwiają określenie czystości próbki badanej poprzez ilościowe ustalenie zawartości poszczególnych zanieczyszczeń lub graniczną kontrolę zanieczyszczeń w tej próbce.

 

oznaczenia zawartości substancji

- umożliwiają ilościowe oznaczenie zawartości głównego/-ych składnika /–ów w substancji aktywnej; lub substancji aktywnej bądź innych wybranych składników w produkcie leczniczym.

 

Walidacja metody polega na sprawdzeniu określonych parametrów walidacyjnych (Tabela 1). Zakres walidacji zależy od rodzaju metody i jest dokładnie sprecyzowany przez wytyczne ICH. Zadaniem producenta leków jest natomiast określenie kryteriów akceptacji dla poszczególnych parametrów. Zgodnie z wytycznymi GMP, „odpowiedniość wszystkich stosowanych metod badawczych powinna zostać sprawdzona i udokumentowana w rzeczywistych warunkach stosowania”.1

 

 

Tabela 1. Parametry walidacyjne metod analitycznych.

Walidacja metody jest procesem jednorazowym, przeprowadzanym po opracowaniu metody, w celu zademonstrowania, że jest ona trafna z naukowego punktu widzenia i że służy zamierzonym celom analitycznym. W pewnych przypadkach konieczna jest jednak rewalidacja, czyli ponowna walidacja metody. Przeprowadza się ją np. wówczas gdy:

 

  • zmieniła się synteza substancji aktywnej,
  • zmienił się skład produktu leczniczego,
  • wprowadzono zmiany w metodzie analitycznej,
  • nastąpiły zmiany w procesach technologicznych produktu luzem,
  • zastosowano nowe wyposażenie o odmiennej charakterystyce,
  • zmieniono dostawców/jakość odczynników chemicznych,
  • nastąpiła zmiana lokalizacji wyposażenia lub warunków środowiskowych w laboratorium.

 

Zakres rewalidacji zależy od rodzaju wprowadzonych zmian, niekiedy koniecznym może być sprawdzenie wszystkich parametrów metody.

 

SPECYFICZNOŚĆ

Specyficzność  metody  oznacza brak efektu oddziaływania innych substancji, które mogą być obecne w badanej próbce (np. zanieczyszczeń produkcyjnych, produktów rozpadu; substancji pomocniczych itp.) na substancję badaną/oznaczaną. Prawidłowo opracowane metody badań tożsamości muszą umożliwiać rozróżnienie dwóch związków o podobnej budowie (strukturze), których występowanie w próbce badanej jest bardzo prawdopodobne. W tym celu porównuje się np. wyniki uzyskane dla próbek zawierających badany analit z wynikami badań próbek wzorcowych nie zawierających tych substancji. Dla metod HPLC sprawdza się np. rozdzielczość układu chromatograficznego (SST) używając roztworów kontrolnych (wzorcowych); albo wykonuje analizę czystości piku, z użyciem detektora fotodiodowego (PDA).

 

LINIOWOŚĆ

Liniowość metody analitycznej ma wykazać, że uzyskane wyniki pomiaru są wprost proporcjonalne do stężenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w danym zakresie.

 

Liniowość opisana jest równaniem matematycznym:

 

y = ax + b

 

w którym:

y – sygnał analityczny substancji oznaczanej,

x – stężenie substancji oznaczanej,

a – współczynnik nachylenia,

b – współczynnik przesunięcia.

 

Krzywą regresji należy wyznaczyć  na podstawie wyników analizy roztworów wzorcowych, na co najmniej 5-ciu poziomach stężeń z danego zakresu, wykonując najczęściej 3 powtórzenia dla każdego z roztworów.

 

Opisując liniowość metody należy zawsze podać wartości współczynników krzywej regresji: a i b, wartość współczynnika korelacji r (opisującego zależność między zmiennymi x i y) oraz graficzne przedstawienie zależności sygnału względem stężenia analitu. Istotne jest aby wartość współczynnika przesunięcia b była jak najbliższa zeru, tzn. aby prosta regresji przechodziła przez punkt przecięcia osi współrzędnych. Istotnie różniący się od zera współczynnik przesunięcia b świadczy o braku specyficzności metody lub o pojawieniu się błędu systematycznego zmieniającego w istotny sposób wartość sygnału pomiarowego y dla stężeń w badanym zakresie. Przyczyny tych błędów mogą być związane np. z wpływem placebo, użytymi odczynnikami, materiałami pomocniczymi lub wynikać z charakterystyki przyrządu pomiarowego.

 

DOKŁADNOŚĆ

Dokładność metody pokazuje zgodność  między wartością, która jest przyjęta jako prawdziwa lub wzorcowa, a wartością będącą wynikiem analizy. Na dokładność metody składa się jej poprawność i precyzja. Dokładność można ustalić na kilka sposobów:

 

  1. przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą, z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana

 

  1. przez analizę próbki o znanym stężeniu (np. certyfikowany materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wartością prawdziwą

 

  1. przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.

 

Zgodnie z wytycznymi ICH, dokładność metody musi być oszacowana na podstawie minimum 9 wyników oznaczeń dla minimum 3 różnych poziomów stężeń z badanego zakresu, np.:  trzykrotne oznaczenie dla trzech poziomów stężeń. Miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej błędu systematycznego, który najczęściej ocenia się statystycznie za pomocą tzw. odzysku, zgodnie z równaniem:

 

 

gdzie:

xi - oznaczona ilość analitu w badanej próbce

µ - rzeczywista ilość analitu w badanej próbce

 

Wydajność odzysku może zależeć od sposobu wykonania analizy (w szczególności etapu ekstrakcji), rodzaju placebo i stężenia oznaczanego w nim analitu. Dopuszczalne wartości odzysku w zależności od oznaczanego stężenia analizowanej substancji w próbce, zostały określone np.: przez AOAC3 (ang. Association of Official Analytical Chemist) iprzedstawione w  Tabeli 2.

 

 

Tabela 2. Wartości odzysku i RSD w zależności od stężenia analizowanej substancji w próbce.

PRECYZJA

Precyzja metody określa stopień zgodności serii wyników tej samej jednorodnej próbki w określonych warunkach pomiaru. Parametrami charakteryzującymi precyzję są: odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe (RDS) wyników oraz przedział ufności wartości średniej. Precyzja wyników metody analitycznej zależy od stężenia analitu w badanej próbce. Dopuszczalne graniczne wartości precyzji wyników (RSD) w zależności od stężenia analitu, określone np.: przez wytyczne AOAC 3,przedstawia Tabela 2.

 

Precyzję dzieli się na 3 rodzaje:

- powtarzalność

- precyzję pośrednią

- odtwarzalność

 

Powtarzalność – wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w tym samym laboratorium w krótkim odstępie czasu (najczęściej 1 dzień), przez tego samego analityka, na tym samym przyrządzie i przy zastosowaniu tych samych odczynników i roztworów. Oceny dokonuje się na podstawie minimum 6 powtórzeń dla poziomu stężenia 100%, lub minimum 9 oznaczeń mieszczących się w zakresie metody (np. trzy powtórzenia dla każdego z minimum trzech poziomów stężeń).

 

Precyzja pośrednia – związana jest najczęściej z oznaczeniem tych samych próbek w tym samym laboratorium, ale w różne dni przez różnych analityków, przy użyciu różnej aparatury i odczynników (od różnych dostawców lub o różnych numerach serii). Precyzja pośrednia ma na celu udowodnienie, że w ramach tego samego laboratorium uzyskiwane będą powtarzalne wyniki analiz w dłuższym okresie czasu, już po zakończeniu etapu opracowywania metody.

 

Odtwarzalność – pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych rezultatów w różnych laboratoriach, z różnymi analitykami, na innym sprzęcie i w innych warunkach środowiska (np.: temperatury i wilgotności), z zachowaniem parametrów wymaganych w opisie metody. Badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności, wtedy gdy metoda ma być stosowana w różnych laboratoriach.

 

ZAKRES

Zakres metody analitycznej opisuje przedział między górnym a dolnym stężeniem oznaczanej substancji w próbce, w którym metoda jest odpowiednio dokładna, precyzyjna i liniowa. Parametr ten wyrażają te same jednostki co wyniki zastosowanej metody (%, ppm, itp.).

 

GRANICA WYKRYWALNOŚCI (LOD)

Granica wykrywalności to:

 

  • punkt, w którym mierzona wartość jest większa od niepewności związanej z jej pomiarem,
  • najmniejsze stężenie substancji w próbce, które może być wykryte, ale nie koniecznie oznaczone ilościowo.

 

Granicę wykrywalności wyznacza się jedną z trzech metod:

 

1. Ocena wizualna

dla szeregu próbek o znanych, zmieniających się stężeniach, ustala się minimalny poziom, przy którym badana substancja może zostać wykryta wizualnie.

 

2. Na podstawie stosunku sygnału do szumu linii podstawowej

 jako wartość LOD przyjmuje się wartość stosunku sygnału danego analitu do szumu linii podstawowej w zakresie od 3:1 do 2:1.

 

3. Na podstawie odchylenia standardowego

wyznacza się odchylenie standardowe (σ) odpowiedzi ślepej próby lub wyrazu wolnego krzywej regresji i oblicza się wartość LOD zgodnie ze wzorem:

 

 

gdzie : 

σ – odchylenie standardowe odpowiedzi

s – współczynnik nachylenia krzywej regresji

 

GRANICA OZNACZALNOŚCI (LOQ)

Granica oznaczalności wyraża najniższe stężenie substancji badanej w próbce, które może być oznaczone z odpowiednią precyzją i dokładnością.

 

Granicę oznaczalności wyznacza się w sposób analogiczny do granicy wykrywalności, przyjmując następujące kryteria akceptacji:

 

1. Ocena wizualna

ustala się minimalny poziom, przy którym analit można oznaczyć z akceptowaną precyzją i dokładnością.

 

2. Na podstawie stosunku sygnału do szumu linii podstawowej

jako wartość LOQ przyjmuje się wartość stosunku sygnału do szumu linii podstawowej równy 10:1.

 

3. Na podstawie odchylenia standardowego

LOQ oblicza się zgodnie z wzorem:

 

 

gdzie:

σ – odchylenie standardowe odpowiedzi

s – współczynnik nachylenia krzywej regresji

 

ODPORNOŚĆ

Odporność metody ma udowodnić niezawodność i prawidłowość wykonania analizy po wprowadzeniu niewielkich, celowych zmian w parametrach metody, takich jak:

 

  • stabilność analizowanych roztworów
  • czas ekstrakcji
  • w metodach chromatograficznych
  • pH fazy ruchomej
  • skład fazy ruchomej
  • temperatura kolumny
  • szybkość przepływu fazy ruchomej
  • rodzaj kolumny chromatograficznej (inny numer serii/inny dostawca)

 

LITERATURA

  1. Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania.
  2. ICH Q2(R1) „Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology”.
  3. AOAC Peer verified methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Virginia, USA, Nov. 1993.

 

Komentarze napędza: Disqus

Pasaż laboratoryjny

articles

Laboratoria w Polsce

Nasze czasopismo - Laborant

Limit_200x300_ok_adka_laborant_8

Numer 8/2014

Temat przewodni: Diagnostyka laboratoryjna